有氧运动调节转化生长因子β/Smad通路缓解db/db糖尿病小鼠的肝脏纤维化

背景:有氧运动可抑制糖尿病小鼠肝纤维化,但具体作用机制尚未阐明。目的:基于转化生长因子β/Smad信号通路探讨有氧运动改善db/db小鼠肝纤维化的作用机制。方法:将8周龄雄性db/db小鼠和年龄匹配的m/m小鼠随机分为m/m对照组、m/m+运动组、db/db对照组、db/db+运动组,每组10只,运动组小鼠接受12周有氧运动。运动结束后检测各组小鼠空腹血糖,进行葡萄糖耐量测试和胰岛素耐量测试;摘取肝脏计算肝脏指数,摘眼球取血检测生化指标;苏木精-伊红染色、油红O染色和Masson染色观察小鼠肝组织的病理变化,免疫组化检测肝组织中转化生长因子β1、p-Smad3的表达;Western blot检测肝组织中转化生长因子β1、Smad3、p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达水平。结果与结论:①与m/m组和m/m+运动组小鼠相比,db/db组小鼠体质量、肝质量、肝脏指数、空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白和肌酶水平均显著升高(P<0.01);高密度脂蛋白水平显著降低(P<0.01);转化生长因子β1、p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达水平显著升高(P<0.01);葡萄糖、胰岛素耐量测试的曲线下面积显著增加(P<0.01);肝组织病理染色显示大量炎症细胞浸润,脂滴增多,明显纤维化;②与db/db组相比,db/db+运动组小鼠体质量、肝质量、肝脏指数、空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白和肌酶水平显著降低(P<0.05或P<0.01);高密度脂蛋白水平显著升高(P<0.05);转化生长因子β1、p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01);此外,糖耐量、胰岛素耐量测试的曲线下面积明显减少(P<0.01,P<0.05),肝脏病理损伤得到明显改善;③结果表明,有氧运动有效减轻了糖尿病小鼠肝纤维化,其机制可能与调控转化生长因子β/Smad信号通路有关。

BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

背景:先天性马蹄内翻足主要表现为骨本身异常及软骨发育异常,BMP/Smad信号通路可以指导胚胎期骨和软骨的发育,但其在马蹄内翻足病因领域发挥的作用尚无动物实验证实。目的:探讨BMP/Smad信号通路参与调控先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常的机制。方法:将生长状况相同的孕10 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组采用135 mg/kg维甲酸灌胃制作马蹄内翻足模型,对照组采用等量植物油灌胃;孕21 d后剖腹取出胎鼠,实验组孕鼠产下胎鼠41只中出现马蹄足畸形27只,畸型率65.9%;对照组获得胎鼠36只,均未出现畸形。分离胎鼠足踝部组织进行苏木精-伊红染色,并采用Western blot、RT-qPCR、免疫组化检测BMP/Smad信号通路核心蛋白Smad5、P-Smad5、通路下游蛋白SP7以及Sox9的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,苏木精-伊红染色可见实验组大鼠足踝部组织中软骨基质增多,骨间缝隙增大;②免疫组化显示实验组Smad5与SP7表达水平下降,而Sox9基因表达增高;③RT-qPCR结果显示实验组大鼠足踝部组织中Smad5、SP7的mRNA表达水平下降,Sox9 mRNA表达水平升高;④Western blot结果显示实验组大鼠足踝部软骨组织中P-Smad5/Smad5及SP7表达降低,Sox9表达升高;⑤结果说明,先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨异常的发生与BMP/Smad信号通路传导障碍有关。

入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平与CHB肝纤维化严重程度的相关性及对疾病预后的预测价值

目的探讨入院时血清转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源蛋白2(Smad2)、Smad同源蛋白3(Smad3)及透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平与慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化严重程度的相关性及联合检测对疾病预后的预测价值。方法选取河南省中医院2021年3月至2022年3月收治的78例CHB肝纤维化患者作为研究组,选择同期78名健康体检者作为对照组。比较研究组和对照组及不同肝纤维化分期、不同炎症活动分级CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平;分析入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平与肝纤维化分期、炎症活动分级的相关性。CHB肝纤维化患者治疗3个月后,根据患者预后分为预后良好和预后不良亚组,比较预后良好和预后不良患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平;分析入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平联合检测对CHB肝纤维化患者预后不良的预测价值。结果研究组入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ高于对照组(P<0.05);不同肝纤维化分期、炎症活动分级CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ比较:S1<S2<S3<S4、G1<G2<G3<G4,差异有统计学意义(P<0.05);入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平与肝纤维化分期、炎症活动分级均呈正相关(P<0.05)。预后良好患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均低于预后不良患者(P<0.05);入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平联合预测肝纤维化患者预后不良的曲线下面积(AUC)优于各指标单一检测(P<0.05)。结论CHB肝纤维化患者入院时血清TGF-β1、Smad2、Smad3、HA、PCⅢ、LN、CⅣ水平均呈现高表达,且与肝纤维化分期、炎症活动分级密切相关,其联合检测对CHB肝纤维化患者预后有较高的预测价值,可用于评估CHB肝纤维化患者病情严重程度和预后,为制定针对性治疗措施提供参考。

化瘀杀胚汤联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠的疗效及对TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p表达量的影响

【目的】探讨化瘀杀胚汤(由丹参、赤芍、桃仁、蜈蚣、紫草、天花粉、三七等中药组成)联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠疗效及对患者TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p表达量的影响。【方法】将104例异位妊娠患者随机分为观察组和对照组,每组各52例。对照组给予甲氨蝶呤联合米非司酮治疗,观察组在对照组的基础上加用化瘀杀胚汤治疗,连续用药3 d并随访观察1个月。比较2组患者保守治疗成功率、血β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平恢复正常时间以及异位妊娠包块吸收时间、治疗后输卵管完全通畅率与不通畅率,观察2组保守治疗成功患者治疗前后血清TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量的变化情况。【结果】(1)观察组的保守治疗成功率为94.23%(49/52),明显高于对照组的71.15%(37/52),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比较,观察组的血β-HCG恢复正常时间及包块吸收时间均明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)观察组治疗后的输卵管完全通畅率为55.77%(29/52),明显高于对照组的21.15%(11/52);不通畅率为19.23%(10/52),明显低于对照组的59.62%(31/52),差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(4)与治疗前比较,2组保守治疗成功患者治疗结束1个月后的TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量均明显降低(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,观察组治疗结束1个月后的TGF-β/Smad2/3蛋白水平和microRNA-30d-5p相对表达量均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。(5)2组患者的不良反应均以胃肠道不适为主,观察组的不良反应发生率为25.00%(13/52),明显低于对照组的46.15%(24/52),组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】化瘀杀胚汤联合甲氨蝶呤治疗异位妊娠,可有效提高药物保守治疗的成功率,有助于包块的吸收以及输卵管通畅,能有效降低患者的TGF-β/Smad2/3蛋白水平及microRNA-30d-5p的相对表达量,且药物安全性较高。

SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊卵巢活动中的功能分析

为探究SMAD基因家族重要成员SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊繁殖活动中的生物学功能,利用生物信息学技术对SMAD2、SMAD3和SMAD4基因的蛋白理化性质、亲疏水性和亚细胞定位进行分析,并对其二级结构、蛋白互作进行预测及GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)的富集分析;然后以小尾寒羊为研究对象,通过免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)确定SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白在卵巢组织中的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blot,WB)方法测定SMAD2、SMAD3和SMAD4基因mRNA及其编码蛋白在不同生理阶段卵巢组织和不同直径卵泡中表达水平。结果显示,SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白为亲水性蛋白,理论等电点分别为6.67、6.73和6.50,在不同生理阶段卵巢组织中的阳性表达主要位于卵母细胞、卵泡膜细胞和颗粒细胞,且二级结构中α螺旋和无规则卷曲的占比较高,其蛋白与FOXH1、ACVR1B、SMAD1、TGFβR1、TGFβR2、ZFYVE9、SKI、SKIL、TGIF1和ENSOARP0000001869蛋白存在互作关系。SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在TGF-β受体信号通路、TGF-β受体结合、TGF-β激活受体活性中发挥生物学功能,且在TGF-β信号通路富集。SMAD2和SMAD4蛋白在撤栓后42 h卵巢组织中的表达量显著高于撤栓后18 h,其mRNA表达趋势及其编码蛋白表达趋势总体一致;而SMAD3基因mRNA及其编码蛋白的表达量在不同生理阶段卵巢组织中差异不显著。SMAD3基因mRNA及其编码蛋白在中卵泡中的表达量显著高于大卵泡;SMAD2和SMAD4基因表达量在不同直径卵泡中差异不显著。综上所述,SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊卵巢周期性活动中的生物学功能存在差异,SMAD2和SMAD4基因参与小尾寒羊发情初期至排卵前的卵巢生理变化,但不参与卵泡发育;而SMAD3参与卵泡发育。以上研究结果为进一步探索SMAD基因家族在小尾寒羊卵巢活动中的分子机理提供理论参考。

不同FecB基因型和不同直径绵羊卵泡中BMP/SMAD通路活性及蛋白表达差异

旨在探究不同FecB基因型对绵羊卵泡中BMP/SMAD通路活性和蛋白表达的影响;揭示成熟大卵泡和小卵泡之间BMP/SMAD通路活性和蛋白表达的差异。本研究采用TaqMan分型方法筛选出不同FecB基因型的母羊,同期发情后取卵泡期成熟卵泡和黄体期卵巢表面小卵泡,利用免疫印迹法(Western blot)测定BMP/SMAD通路相关蛋白表达水平和通路活性。结果表明,对于小卵泡组,FecB突变型卵泡中骨形态发生蛋白1B型受体(bone morphogenetic protein receptor type 1B,BMPR1B)表达量显著高于野生型卵泡(P<0.05),但SMAD家族成员4(SMAD family member 4,SMAD4)表达量和SMAD1/5/9的磷酸化水平显著低于野生型卵泡(P<0.05);对于成熟大卵泡组,FecB突变型卵泡中FKBP脯氨酰异构酶1A(FKBP prolyl isomerase 1A,FKBP1A)和SMAD4表达量显著低于野生型卵泡(P<0.05),Ⅰ型受体(BMPR1B)和Ⅱ型受体(BMPR2)的蛋白表达量及SMAD1/5/9的磷酸化水平在两种基因型之间未显示出显著差异。另一方面,对比FecB突变型小卵泡和成熟大卵泡发现:成熟大卵泡中BMPR1B和SMAD4蛋白表达量和SMAD1/5/9磷酸化程度显著高于小卵泡(P<0.05)。上述结果表明,由于SMAD4表达量的下降,FecB突变型大、小卵泡中结合到基因组靶区域的SMAD4-SMAD1/5/9蛋白复合物均相对较少,将导致通路活性降低,而且由于小卵泡中较低的SMAD1/5/9磷酸化水平,其通路活性更低。另外,绵羊突变型卵泡生长发育成熟后BMP/SMAD通路活性显著增强。

胰腺上皮内瘤变和胰腺癌组织中TGF-β/Smad信号通路相关蛋白表达

目的探讨转化生长因子(TGF)β/Smad信号传导通路中Smad相关蛋白、TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体在胰腺上皮内瘤变(PanIN)和胰腺癌组织中表达的意义。方法用免疫组化EnVision法和SP法检测266灶不同级别PanINs和121例胰腺癌组织中Smad相关蛋白、TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体的表达,并联系临床病理学指标进行相关分析。结果高级别PanIN病灶Smad4表达率(60.6%,20/33)低于低级别PanINSmad4表达率(79.8%,186/233)(P<0.05);而高级别PanIN中Smad7,TGFβ1,TGFβRⅡ表达率明显高于低级别PanIN(P<0.05)。胰腺癌组织中,Smad4蛋白表达率在淋巴结转移组和神经受累组低于各自对照组(P<0.05);Smad7、TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体的表达率在淋巴结转移组和神经受累组则分别高于各自对照组(P<0.05)。PanIN和胰腺癌组织中Smad2、4、7蛋白,TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体表达率的差异具有显著性(P<0.01)。结论从低级别PanINs到高级别PanINs再到胰腺癌中,Smad4蛋白表达率逐渐降低,而Smad7、TGFβ1及其Ⅰ、Ⅱ型受体表达率逐渐升高,支持胰腺癌形成的分子模型。

基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

贲门腺癌组织中Smad基因家族不同成员的表达及其临床意义

目的:检测贲门腺癌(gastric cardia adenocarcinoma,GCA)中Smad基因家族不同成员的表达水平及其相关性,并探讨其临床意义。方法:收集河北医科大学第四医院2004至2009年间病理确证的贲门腺癌患者110例,RT-PCR检测贲门腺癌和癌旁组织中Smad2、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA的表达,免疫组织化学方法检测贲门腺癌组织和癌旁组织中p-Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白的表达并分析其相关性,分析p-Smad2/3、Smad4和Smad7蛋白表达与贲门腺癌临床病理特征的关系。结果:贲门腺癌组织中Smad2、Smad3和Smad4 mRNA表达水平均显著低于相应癌旁组织[(0.4956±0.1862)vs(0.8611±0.2914),P<0.01;(0.4713±0.1712)vs(0.8314±0.2811),P<0.01;(0.5145±0.1987)vs(0.8954±0.2856),P<0.01],而Smad7 mRNA表达水平显著高于癌旁组织[(0.5114±0.1962)vs(0.2012±0.1006),P<0.01]。贲门腺癌组织p-Smad2/3、Smad4蛋白表达的阳性率显著低于癌旁组织(42.7%vs 93.6%,P<0.01;45.5%vs 95.5%,P<0.01),且与肿瘤TNM分期和组织分化程度密切相关(P<0.05)。贲门腺癌组织Smad7蛋白表达阳性率显著高于癌旁组织(48.2%vs 3.6%,P<0.01),且与肿瘤组织分化程度密切相关(P<0.05)。贲门腺癌中p-Smad2/3与Smad4蛋白的表达呈正相关,但它们均与Smad7蛋白表达无明显的相关性。结论:贲门腺癌组织低表达Smad2、Smad3和Smad4,高表达Smad7,Smad基因的异常表达可能参与贲门腺癌的发生、发展。

虎杖苷通过抑制TGF-β/Smad信号通路改善动脉粥样硬化大鼠动脉粥样硬化斑块和内皮炎症反应

目的:探讨虎杖苷通过抑制转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路对动脉粥样硬化(AS)大鼠AS斑块和内皮炎症反应的改善作用。方法:将60只大鼠随机分成空白对照组、模型对照组、虎杖苷低、中、高剂量组和阳性对照组,每组10只。正常对照组大鼠用普通饲料喂养,其余各组大鼠采用高脂饲料喂养与维生素D3腹腔注射联合的方法制备AS大鼠模型。虎杖苷低、中、高剂量组大鼠每天灌胃虎杖苷40、80、160 mg/kg,阳性对照组大鼠每天灌胃辛伐他汀5 mg/kg,模型对照组和空白对照组大鼠每天灌胃等量生理盐水。给药结束后,油红O染色观察大鼠主动脉AS斑块形成情况;全自动生化分析仪检测大鼠三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平;酶联免疫吸附法检测大鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、IL-8、C反应蛋白(CRP)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、同型半胱氨酸(Hcy)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、内皮素-1(ET-1)含量;蛋白免疫印迹法检测大鼠TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,模型对照组大鼠主动脉内壁出现大量AS斑块,血清中TG、TC、LDL-C水平及TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、MCP-1、Hcy、ICAM、ET-1含量明显升高,HDL-C水平明显降低,主动脉组织中TGF-β1蛋白表达、p-Smad2/3/Smad2/3显著升高(P<0.05)。虎杖苷干预后AS大鼠主动脉内壁斑块面积明显减小,血清中TG、TC、LDL-C水平及TNF-α、IL-6、IL-8、CRP、MCP-1、Hcy、ICAM、ET-1含量显著降低,HDL-C水平显著升高,主动脉组织中TGF-β1蛋白表达、p-Smad2/3/Smad2/3明显减小(P<0.05),以上指标变化均呈剂量依赖性(P<0.05)。阳性对照组TC、LDL-C、HDL-C水平与虎杖苷高剂量组无明显差异(P>0.05),其余指标均比虎杖苷高剂量组更低(P<0.05)。结论:虎杖苷通过调节血脂、降低细胞炎症因子的表达,从而减少AS斑块的形成,改善AS大鼠体内的炎症反应,其机制与抑制TGF-β/Smad信号通路激活有关。

金雀异黄素通过调控TGF-β1/Smad3信号通路对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨金雀异黄素减轻糖尿病大鼠心肌纤维化的作用及潜在机制。方法 通过高脂饮食结合腹腔注射链脲菌素(STZ)法建立大鼠2型糖尿病(T2DM)模型,并随机分为模型组、二甲双胍组(100 mg/kg)及金雀异黄素低、高剂量组(50、100 mg/kg),另设正常组给予常规饮食,每组10只。各给药组灌胃给药8周,检测体质量、心功能、心脏质量及心脏指数,血清CK-MB、AST及LDH活性,观察心肌纤维化程度,心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源物3(Smad3)mRNA和蛋白表达,心肌组织Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)蛋白分布及表达。结果 与模型组比较,金雀异黄素各剂量组大鼠体质量、每搏输出量(SV)及射血分数(EF)升高(P<0.01),心脏指数、左心室收缩末期内径(LVIDs)、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织胶原相对面积及CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),金雀异黄素高剂量组左心室舒张末期内径(LVIDd)降低(P<0.05)。结论 金雀异黄素可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化作用,进而发挥保护心脏效应。

美洲大蠊提取液对大鼠难愈合创面TGF-β1/Smads通路调控机制的研究

目的:探讨美洲大蠊提取液对难愈合创面TGF-β1/Smads通路调控机制的研究。方法:选取SPF级Wistar大鼠60只,采用随机数字表法将其分为空白组(急性全层皮肤缺损组)、模型组、对照组(贝复济组)、实验组(美洲大蠊提取液组),每组15只。空白组建立全层皮肤缺损开放性创面,模型组、对照组、实验组建立全层皮肤难愈合创面。造模后3天、8天、15天、20天留取创面新鲜肉芽组织,运用免疫组化观察TGF-β1、Smad3、Smad7的表达,Western blot观察TGF-β1,Smad3、Smad7及其磷酸化的表达。结果:两种实验方法均显示空白组创面愈合速度最快,模型组愈合缓慢。免疫组化发现实验组与模型组TGF-β1、Smad7的表达比较有统计学意义(P <0.05),Smad3的表达结果显示实验组与模型组比较,3d无明显差异(P> 0.05),8天、15天、20天有统计学意义(P <0.05)。Western blot实验显示TGF-β1、Smad7、psmad3的表达,实验组与模型组比较有统计学意义(P <0.05);各组间Smad3的表达比较均无统计学意义(P> 0.05),psmad7的表达结果显示,实验组与模型组比较,3-8天无统计学意义(P> 0.05),15-20天有统计学意义(P <0.05)。结论:美洲大蠊提取液下调Smad3表达水平的现象不显著,但能引起Smad3的磷酸化;其能有效降低Smad7的表达,减少Smad7的自身磷酸化,从而减弱Smad7对TGF-β1信号转导的抑制,提高TGF-β1的表达而促进创面愈合。

基于TGF-β/BMP/Smad信号通路治疗激素性股骨头坏死中医药研究进展

激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SIONFH)是由于糖皮质激素使用不当或过度而引起的髋关节疾病,发病机制尚未统一,临床疗效亦不佳。当前,没有效果明确的药物可以延缓疾病进程,而中医药治疗SIONFH在临床上取得一定疗效。即便如此,仍未能完整的从分子生物及细胞生物学角度阐明中药治疗SIONFH的作用机制。转化生长因子-β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)/Smad信号通路的转导是防治SIONFH的研究热点之一,故该文阐明了该信号通路的转导机制以及与SIONFH的联系,检索了基于该通路治疗SIONFH的全部中药及复方并阐述其影响机制。基于中医对SIONFH的认识,现临床上使用补肝肾强筋骨以及活血祛瘀通络类的方药治疗SIONFH,且具有良好的疗效。中药通过调控该通路,可刺激骨髓间充质干细胞成骨分化,降低破骨细胞含量,减少脂肪生成,改善微循环,抗氧化损伤,促进股骨头内血管新生,从而促进股骨头损伤的修复。现基于TGF-β/BMP/Smad信号通路对中医药治疗SIONFH的研究进展做一综述,期许为中医药治疗SIONFH提供理论依据及参考。

Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用。培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Westernblot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异。结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显著受到抑制。表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应。

逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6/Smads通路表达的影响

目的:观察逍遥丸对小鼠卵母细胞BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4表达的影响。方法:将200只雌性小鼠按随机数字表法分为疏肝高、低剂量组、COH组和空白对照组4组各50只。应用免疫组化和real-time PCR方法分别测定卵母细胞中BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA的表达。结果:与空白对照组比较,COH组BMP-6、BMPR II、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达差异无统计学意义,各治疗组BMP-6、ALK-2、ALK-6、Smad1、Smad5、Smad8和Smad4蛋白和mRNA表达增加,疏肝高剂量组优于低剂量组;疏肝高剂量组BMPR II蛋白和mRNA表达增加。结论:逍遥丸可使BMP-6表达上调,激活其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成受体复合物,然后募集Ⅰ型受体ALK-2和ALK-6使其活化,活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化细胞内信号Smad1/5/8,然后与Smad4结合,从而启动信号传导干预卵泡发育和卵母细胞的质量。

恩度调控TGF-β/TβR/Smad2/3通路对大鼠HSC-T6细胞人肝癌HepG2细胞凋亡及迁移能力的影响

目的探讨恩度调控转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/转化生长因子-β受体(TGF-βreceptor,TβR)/Smad2/3通路对大鼠HSC-T6细胞、肝癌HepG2细胞凋亡及迁移能力的影响。方法体外培养大鼠HSC-T6细胞、人肝癌HepG2细胞,均分为空白对照组、TGF-β1组(加入TGF-β1处理1 h)、TGF-β1+低剂量恩度组(加入TGF-β1处理1 h后加入20 pmol/L恩度处理24 h)、TGF-β1+中剂量恩度组(加入TGF-β1处理1 h后加入40 pmol/L恩度处理24 h)、TGF-β1+高剂量恩度组(加入TGF-β1处理1 h后加入80 pmol/L恩度处理24 h)。每组均设置3个复孔,且完成3次独立重复实验。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,采用划痕法检测细胞迁移率,采用免疫印迹法检测TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表达量。结果与空白对照组相比,TGF-β1组的细胞凋亡率降低,细胞迁移率增加,TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3蛋白表达量增加(P<0.05)。与TGF-β1组相比,TGF-β1+低、中、高剂量恩度组的细胞凋亡率增加,细胞迁移率降低,TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表达量降低(P<0.05)。结论恩度可能通过下调TGF-β/TβR/Smad2/3通路,促进大鼠HSC-T6细胞、肝癌HepG2细胞凋亡,并抑制细胞迁移能力,从而发挥抗肝纤维化、肝癌作用。

脂溢性角化病皮损区受体活化Smad的变化

目的探讨转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号转导通路中受体活化Smads(Smad2,Smad3)在脂溢性角化病皮损区的表达及其意义。方法采用反转录-实时定量聚合酶链式反应(RT and quantitative Real-Time PCR)和免疫组化技术分别检测脂溢性角化病皮损和正常对照皮肤中Smad2及Smad3的mRNA和Smad1/2/3及磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)蛋白的表达情况。结果与正常对照皮肤组相比,脂溢性角化病皮损中Smad2、Smad3的mR-NA以及Smad1/2/3、p-Smad2/3的表达水平下降。结论脂溢性角化病中受体活化Smads(Smad2、Smad3)和p-Smad2/3表达下调可阻断TGF-β信号转导,可能使TGF-β抑制上皮增生的作用不能有效发挥,从而促进了脂溢性角化病表皮的过度增生。

Smads mRNA在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

目的探讨Smads mRNA在神经元样PC12细胞氧糖剥夺中的表达变化。方法鼠神经生长因子(NGF,50ng/ml)诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的神经元样转化,微管相关蛋白(Microtubule-associated protein 2,MAP2)染色,共聚焦显微镜验证其神经元特性。利用连二亚硫酸钠(Na2S2O4,1mmol/L)构建氧糖剥夺模型(oxygen-glucosedeprivation,OGD),模拟神经细胞缺血性损伤。实时定量RT-PCR检测神经元样细胞OGD 0,3和6h后Smad2、4、7基因mRNA的表达变化。结果成功诱导神经元样PC12细胞。OGD处理3h后细胞Smad2、4、7基因mRNA的表达与OGD0h组相比明显升高,分别超过17.7%,413.4%,75.2%。OGD6h,Smad2、7基因mRNA的表达较OGD0h组下调80.9%,57.4%,Smad4mRNA表达较OGD3h组下调73.0%,但与OGD0h相比,表达提高38.8%。结论 ActA/Smads通路激活发生在神经元样细胞OGD损伤的早期(OGD3h);Smad7转录水平上参与该通路的负性调节过程。

姜黄素通过调控TGF-β1/Smad信号通路抑制恶性胶质瘤生长的作用机制

目的探究姜黄素对恶性胶质瘤生长的影响及可能机制。方法以人恶性胶质瘤细胞U87为研究对象,随机分为空白对照组(无任何干预)、姜黄素低、中、高(10、20、40μmol·L^(-1))、替莫唑胺组(40μmol·L^(-1))、姜黄素40μmol·L^(-1)+LY210976110μmol·L^(-1)、姜黄素40μmol·L^(-1)+SRI-01138110μmol·L^(-1),干预48 h。CCK-8法、Transwell法对各组U87细胞活性、迁移及侵袭能力测定,经由流式细胞术测定U87细胞周期变化,Western blot法测定U87细胞TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白表达水平。结果姜黄素组与替莫唑胺组干预48 h后U87细胞活性百分比、细胞迁移及侵袭数目均低于空白对照组(P<0.05),且均随姜黄素剂量增大而下降(P<0.05)。对比空白对照组,姜黄素组及替莫唑胺组Sub-G_(0)期细胞数增多(P<0.05),G_(2)/M期细胞数减少(P<0.05)。姜黄素高剂量组及替莫唑胺组U87细胞TGF-β1、p-Smad 3、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9蛋白相对表达量均低于空白对照组(P<0.05),Smad 7、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白相对表达量均高于空白对照组(P<0.05)。姜黄素高剂量组与替莫唑胺组各指标对比差异均无统计学意义(P>0.05)。相比姜黄素高剂量组,TGF-β1/Smad通路抑制剂能进一步抑制U87细胞活性、迁移及侵袭,降低TGF-β1、p-Smad 3、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量(P<0.05),提高Smad 7、E-cadherin蛋白相对表达量(P<0.05),而TGF-β1/Smad通路激活剂反之(P<0.05)。结论姜黄素能抑制恶性胶质瘤U87细胞生长,其机制可能与调控TGF-β1/Smad信号通路相关。

miR-19a调控TGF-β1/Smad信号通路对胃癌细胞增殖、侵袭及糖酵解的影响

目的:探究微小RNA-19a(miR-19a)通过调控转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路对人胃癌AGS细胞增殖、侵袭和糖酵解的影响。方法:体外培养人胃癌AGS细胞,采用脂质体进行转染分别将inhibitor NC、mimics NC、miR-19a inhibitor、miR-19a mimics转染至人胃癌AGS细胞记为inhibitor NC组、mimics NC组、miR-19a inhibitor组和miR-19a mimics组,不做转染处理的为对照组,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-19a的表达量,用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活力,发现敲低miR-19a可显著抑制胃癌AGS细胞活力。所以后续实验分为对照组、inhibitor NC组、miR-19a inhibitor组、抑制剂组(miR-19a inhibitor转染+10μmol/L TGF-β1/Smad通路抑制剂LY2109761)和激活剂组(miR-19a inhibitor转染+10μmol/L TGF-β1/Smad通路激活剂SRI-011381),采用RT-qPCR法、5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、Transwell小室、乳酸、葡萄糖检测试剂盒及蛋白免疫印迹(WB)法分别对细胞miR-19a的表达、增殖率、侵袭数、乳酸含量、葡萄糖消耗水平及糖酵解、TGF-β1/Smad相关蛋白表达水平进行分析。结果:敲低miR-19a可显著抑制胃癌AGS细胞活力,所以选用转染miR-19a inhibitor进行后续通路验证实验。结果发现,对照组与inhibitor NC组在miR-19a的表达水平、细胞增殖率、侵袭数、葡萄糖消耗及乳酸水平、增殖细胞核抗原(PCNA)、己糖激酶2(HK2)、乳酸脱氢酶A(LDHA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达水平等各项指标均无统计学差异(P>0.05)。miR-19a inhibitor组细胞miR-19a的表达、增殖率、侵袭数、葡萄糖消耗及乳酸水平、PCNA、HK2、LDHA、GAPDH、TGF-β1、p-Smad3蛋白水平低于inhibitor NC组(P<0.05)。抑制剂组细胞miR-19a的表达、增殖率、侵袭数、葡萄糖消耗及乳酸水平、PCNA、HK2、LDHA、GAPDH、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达水平低于miR-19a inhibitor组,而激活剂组这些指标高于miR-19a inhibitor组(P<0.05)。结论:下调miR-19a可抑制人胃癌AGS细胞增殖、侵袭和糖酵解,其作用机制与阻滞TGF-β1/Smad信号转导有关。