缺血性脑卒中致血管性痴呆患者血清HOXA1 及SMAD3基因表达与认知功能和预后的关系

目的探讨缺血性脑卒中致血管性痴呆(VD)患者血清同源异性盒基因A1(HOXA1)、SMAD家族成员3(SMAD3)基因表达与认知功能和预后的关系研究。方法选择2021年1月—2023年2月辽宁省金秋医院神经内科收治的缺血性脑卒中患者241例为研究对象,根据3个月后是否发生VD分为痴呆组(n=117)和非痴呆组(n=124)。根据痴呆组患者出院3个月后预后功能障碍分为Ⅰ级亚组(n=48)、Ⅱ级亚组(n=43)、Ⅲ级亚组(n=26)。Spearman相关性分析缺血性脑卒中致VD患者血清HOXA1和SMAD3基因表达与简易精神状态量表(MMSE)评分的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清HOXA1和SMAD3基因表达对缺血性脑卒中致VD患者预后功能障碍为Ⅲ级的预测价值。结果与非痴呆组比较,痴呆组血清HOXA1和SMAD3基因表达均明显升高(t=30.176、16.855,P<0.001);缺血性脑卒中致VD患者轻度亚组、中度亚组、重度亚组血清HOXA1和SMAD3基因表达依次升高,且差异均有统计学意义(F=308.625、153.360,P<0.001);与预后功能障碍Ⅰ~Ⅱ级亚组比较,Ⅲ级亚组患者血清HOXA1和SMAD3基因表达均明显升高(t=8.274、9.396,P<0.01);Spearman相关性分析结果显示,缺血性脑卒中致VD患者血清HOXA1和SMAD3基因表达与MMSE评分均呈显著负相关(r=-0.564、-0.518,P<0.01);血清HOXA1、SMAD3及二者联合预测缺血性脑卒中致VD患者Ⅲ级预后功能障碍的AUC分别为0.772、0.831、0.899,二者联合的AUC大于单项指标(Z/P=2.001/0.045、2.116/0.034)。结论HOXA1和SMAD3基因表达与缺血性脑卒中所致VD患者认知功能和预后密切相关,且血清HOXA1和SMAD3基因表达在缺血性脑卒中所致VD患者预后功能障碍的预测中具有较高的应用价值。

小鼠Smad3基因的克隆及其在小鼠组织中的表达

采用PCR获得的Smad3cDNA片段作为探针筛选小鼠脑cDNA文库 .克隆了小鼠全长的Smad3基因 .对小鼠Smad3基因的全编码区进行了序列测定 .结果表明 ,小鼠SMAD3与人SMAD3氨基酸同源性高达 99% .与小鼠Smad2基因相比 ,碱基同源性高达 91 8% .Northern杂交显示 ,Smad3基因在小鼠胚胎发育和各成体器官中普遍表达 .原位杂交显示 ,Smad3基因表达在小鼠胚胎期E16 5d的软骨。

腺病毒载体介导Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默

旨在通过在秦川牛前体脂肪细胞中过表达和沉默Smad3基因,探讨其在秦川牛前体脂肪细胞分化过程中的生物学功能,从而为阐明TGF-β信号通路在牛脂肪组织生长发育过程中发挥的作用提供理论依据。本试验采用Ad5腺病毒改建的AdMaxTM重组腺病毒包装系统成功重组获得了过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3和干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405。感染牛前体脂肪细胞后,利用实时荧光定量检测Smad3基因及脂肪形成相关基因mRNA的表达。结果表明,将获得的具有较高滴度的过表达腺病毒pDC316-EGFP-bSMAD3感染秦川牛前体脂肪细胞3、6、9d后,分别较对照组Smad3基因表达量显著上调了1 031、1 286、633倍(P<0.001)。与对照组相比,高滴度干扰腺病毒pDC316-EGFP-ShRNA-bSMAD3-1405感染牛前体脂肪细胞3、6、9d后,Smad3基因的表达量分别下调了70%、55%、57%(P<0.01)。油红O染色和实时荧光定量结果均证明,Smad3基因抑制了前体脂肪细胞脂质积累并促使标志基因PPARγ、FABP4、C/EBPα和C/EBPβ的表达显著下调。综上所述,腺病毒载体介导体外表达载体可以成功的实现Smad3基因在秦川牛前体脂肪细胞中的过表达和沉默,并对秦川牛前体脂肪细胞的成脂分化具有一定的调控作用。

Smad3在TGF-β1诱导肌成纤维细胞增殖中的作用

目的探讨TGF-β1及其信号转导分子Smad3在肌成纤维细胞(C2C12)增殖中的作用。方法TGF-β1作用C2C12细胞,对Smad3基因进行RNA干扰,用[3H]测定法检测TGF-β1诱导的C2C12细胞增殖。结果0、1、5和10ng/mLTGF-β1作用C2C12细胞后,其[3H]值(cpm/min)分别是(630±17),(907±19),(1493±25),(1808±24),F=3080.499,P=0.000。经200pmol/LsiRNA-Smad3转染24h,再用5ng/mLTGF-β1作用24h,测定细胞增殖,其[3H]值(cpm/min)分别是(464±30)(空白对照组),(1062±50)(内对照组),(428±38)(实验组),F=412.186,P=0.000。结论TGF-β1通过Smad3信号转导促进C2C12细胞增殖并呈剂量依赖性,siRNA-Smad3可以有效地阻断其信号转导而降低C2C12细胞增殖。

Wistar大鼠smad3 cDNA序列测定及其mRNA水平实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的：克隆和测定Wistar大鼠smad3基因部分序列，构建检测Wistar大鼠smad3基因表达的重组质粒标准品并建立实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）方法。方法：提取并培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞的总RNA，逆转录（RT）-PCR扩增，将扩增产物克隆到PMD-18T载体上，测序分析。用已测定序列的T载体作为标准品建立实时荧光定量PCR方法，并检测转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激对培养Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3 mRNA表达的影响。结果：测定Wistar大鼠smad3基因cDNA序列长415bp，其与人、家鼠、小鼠具有较高的同源性，已被GenBank收录（DQ409172）。建立的实时荧光定量PCR方法在10^3-10^7拷贝数/μl的标准品梯度稀释范围内相关系数为0.98946。25ng/ml TGF-β1刺激后Wistar大鼠皮肤成纤维细胞smad3基因表达升高为PBS刺激对照组的1.5倍。结论：获得Wistar大鼠smad3基因序列并成功建立了smad3实时荧光定量PCR的方法，为Smad3作用的分子机制研究提供了实验基础。

ZHX3基因沉默对BMSCs中BMP2/smad通路的影响

目的:探讨转录抑制因子——锌指蛋白和同源框3(zinc fingers and homeoboxes 3,ZHX3)基因沉默对骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)中BMP2/smad通路相关因子骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)、磷酸化smad1(phospho-smad1(或pho-smad1))表达的影响。方法:构建ZHX3低表达慢病毒载体转染大鼠BMSCs,同时设阴性对照空载病毒转染BMSCs及空白对照不做任何处理的BMSCs。采用荧光显微镜下测定细胞转染率、免疫印迹技术鉴定转染效果、免疫细胞化学和免疫印迹技术定性定量检测ZHX3沉默时BMP2、pho-smad1和smad4的表达情况。细胞经成骨诱导液处理后进行碱性磷酸酶和茜素红染色检测各组细胞成骨能力。结果:1复苏培养的细胞具有BMSCs形态。2转染后,ZHX3低表达组和空载体对照组均表达绿色荧光,转染率分别为(93.18±4.41)%和(92.56±4.35)%,空白对照组不表达荧光,未见转染阳性细胞(F=1 123.464,P<0.05)。3免疫细胞化学及免疫印迹结果显示,BMP2、pho-smad1、smad4于3组细胞内均可见阳性表达,但ZHX3低表达组的BMP2、pho-smad1水平(0.383 0±0.006 3,0.329 1±0.025 8)明显高于空白对照组(0.306 2±0.011 6,0.209 0±0.017 0)和空载体对照组(0.291 2±0.022 2,0.180 0±0.018 7),P<0.05;而ZHX3低表达组smad4的表达(0.107 4±0.004 3)显著低于空白对照组(0.380 1±0.023 6)和空载体对照组(0.353 7±0.016 7),P<0.05。4空白对照组、空载体对照组、ZHX3低表达组均可见碱性磷酸酶阳性表达的细胞及矿化结节,但后者数量均小于前两者。结论:ZHX3基因低表达可延迟BMSCs体外成骨能力,可能通过调控BMP2/smad通路中的smad4来发挥作用。

miR-637靶向SCUBE3对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的miR-637靶向SCUBE3调控结肠癌的作用仍未完全清晰,文章旨在探讨miR-637在结肠癌的表达及其是否靶向SCUBE3影响结肠癌的生长。方法选取20份结肠癌组织和癌旁组织样本及结肠癌细胞系HCT116细胞为研究对象,细胞转染miR-637-mimic、miR-637-inhibitor或/和pcDNA3.1-SCUBE3。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)或免疫组织化学法检测组织miR-637或信号肽-CUB-EGF样结构域蛋白3(SCUBE3)表达;qRT-PCR和CCK-8检测miR-637表达及其对细胞增殖的影响;流式细胞凋亡和蛋白质印迹法(Western blot)分析miR-637对细胞凋亡的影响;荧光素酶实验、qRT-PCR和Western blot检测miR-637与SCUBE3的靶向关系;Western blot检测miR-637对TGFβ/Smad信号通路的调节作用。结果与癌旁组织相比,结肠癌组织miR-637的表达水平(0.61±0.03)显著下调,SCUBE3的表达(1.81±0.09)显著上调(P<0.01);与阴性对照组相比,miR-637 mimic转染后HCT-116细胞中的miR-637表达(1.53±0.08)显著增强(P<0.05),细胞增殖被显著抑制(P<0.01),细胞凋亡显著增加(P<0.01),且Bax蛋白表达显著升高,Bcl-2、p-smad2、p-smad3、TGF-βR2蛋白表达显著降低(P<0.01);SCUBE3是miR-637的靶基因;与miR-637 mimic组相比,pcDNA3.1-SCUBE3明显抑制了miR-637 mimic的促凋亡作用(P<0.01),miR-637 mimic+pcDNA3.1-SCUBE3组Bax蛋白表达显著降低,Bcl-2、p-smad2、p-smad3、TGF-βR2蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论miR-637对结肠癌细胞具有抑制增殖及促凋亡作用,并可能通过靶向SCUBE3和抑制TGF-β/Smad信号通路来抑制结肠癌。

Meg3在全反式视黄酸诱发小鼠腭裂中的作用

目的:探索母系印迹基因3(Meg3)在全反式视黄酸(atRA)诱发腭裂中的作用。方法:妊娠第10天(GD10),将90只孕鼠随机分为atRA组和对照组(每组45只),分别给予100 mg/kg atRA和等体积的玉米油灌胃。HE染色观察GD13、GD14、GD15胎鼠腭部发育情况,BrdU荧光染色观察GD13、GD14、GD15胎鼠腭突间充质细胞增殖情况。在GD14,荧光原位杂交和实时荧光定量PCR法检测两组胎鼠腭突间充质细胞中Meg3的定位和表达,蛋白印迹法检测Smad通路相关蛋白磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad2、Smad4和Smad7的表达,RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测Meg3基因与Smad2蛋白结合情况。结果:Meg3基因主要定位于胎鼠腭突间充质细胞的细胞核。与对照组相比,在GD14,atRA组细胞中Meg3 mRNA表达量升高(P<0.001),p-Smad2和Smad4蛋白表达水平降低(P<0.05),而Smad7蛋白表达水平增加(P<0.001);两组细胞中Meg3基因均可与Smad2蛋白结合,Meg3 mRNA相对表达量atRA组大于对照组(P<0.001)。结论:atRA可能通过促进Meg3与Smad2的结合,影响TGF-β/Smad信号通路的激活,抑制胎鼠腭突间充质细胞的增殖,从而导致腭裂的发生。

单味药鹿茸调控大鼠骨关节炎软骨组织Smad2、3表达的研究

目的观察单味中药鹿茸对大鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨靶器官Smad2、3表达的影响。方法选择3个月龄健康雌性SD大鼠100只,体质量(200±20)g。常规喂养1周后,随机数字表法分成5组:鹿茸低剂量组、鹿茸高剂量组、盐水组、模型组及正常组,每组20只。除正常组外采用经典Hulth方法造模,造模后6周,行病理学观察,确认造模成功,鹿茸低剂量组按0.021 g/100 g给药,鹿茸高剂量组按0.084g/100 g给药,盐水组每天灌服相应的生理盐水,正常组及模型组不予任何处理。于灌胃后2、4、6周,分别取大鼠双侧膝关节软骨,采用免疫组织化学、荧光定量-PCR和蛋白免疫印迹杂交方法分别检测Smad2、3 mRNA和蛋白表达。结果病理观察可见成功制备OA模型,免疫组织化学可见Smad2、3蛋白在软骨层广泛表达,且定位于软骨细胞膜内。与模型组比较,鹿茸低、高剂量组在灌胃后2、4、6周Smad2、3 mRNA表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与同组灌胃后4周比较,灌胃后6周,鹿茸高、低剂量组的Smad2、3mRNA表达量有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,鹿茸低、高剂量组Smad2、3蛋白在灌胃后2、4周时,其在软骨细胞中的表达量有明显的升高,差异有统计学意义(P<0.01);与同组灌胃后2周比较,鹿茸低、高剂量组灌胃后4周升高更显著,差异有统计学意义(P<0.01);与同组灌胃后4周比较,灌胃后6周时鹿茸低、高剂量组Smad2、3蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 (1)鹿茸通过调控软骨细胞内Smad2、3基因和蛋白的表达而起到修复软骨的作用。(2)软骨细胞内的Smad2、3基因表达及蛋白水平的上调可能是OA发病的重要机制之一。

TGF-β_1对肌成纤维细胞MMP-2激活的影响

目的:观察转化生长因子β1(TGF-β1)对鼠肌成纤维细胞(C2C12细胞)分泌基质金属蛋白酶2(MMP-2)及其激活的影响,探讨其内在机制。方法:用不同浓度的TGF-β1(0、1、5、10μg/L)干预C2C12细胞24h,200pmol/LSmad3基因短干扰RNA(siRNA-Smad3)转染C2C12细胞24h,用ELISA方法测定MMP-2及其活性型MMP-2。结果:(1)0、1、5、10μg/LTGF-β1干预C2C12细胞24h,ELISA检测总MMP-2的结果(μg/L)分别为177±20、180±15、171±18、179±28,方差分析无显著差异(P>0.05);活性型MMP-2分别为23.09±4.37、14.42±2.30、9.50±1.18、4.48±0.69,比较差异显著(P<0.01)。(2)5μg/LTGF-β1干预C2C12细胞4h、12h和24h,总MMP-2ELISA值分别为160±16(对照组)/157±17(干预组)、174±6/174±16、187±12/189±18,不同时点干预组总MMP-2值比较无差异,P>0.05;活性型MMP-2值分别为:16.92±1.26(对照组)/16.53±2.56(干预组)、22.70±3.03/8.00±2.02、23.15±2.66/9.39±2.60,干预组活性型MMP-2值比较有差异,P<0.01。(3)200pmol/LsiRNA-Smad3转染C2C12细胞24h,再用5μg/LTGF-β1干预C2C12细胞24h,活性型MMP-2值分别是20.80±1.53(siRNA-control,空白对照组)、9.82±2.18(siRNA-control+5μg/LTGF-β1,内对照组)、20.09±2.27(siRNA-Smad3+5μg/LTGF-β1,实验组);实验组和内对照组比较差异显著(P<0.01),实验组和空白对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:TGF-β1并不影响C2C12细胞分泌MMP2,但显著抑制MMP-2的活化;siRNA-Smad3阻断Smad3信号转导可以消除TGF-β1对MMP-2活化的抑制作用。

2,3,7,8-四氯二苯并二噁英诱发小鼠腭裂的作用及其机制研究

目的探索2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)诱发小鼠腭裂的作用及机制。方法将84只孕鼠根据体质量按随机数字表随机分为TCDD组和对照组(每组42只),在孕期第10天(gestation day 10,GD10)上午8时分别给予64μg/kg TCDD和等量玉米油灌胃。HE染色观察GD13~GD15胎鼠腭发育的形态学变化,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)免疫荧光观察TCDD对GD13~GD15胎鼠腭突间充质细胞增殖的影响,原位杂交和实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测母系印记基因3(maternally expressed gene3,MEG3)在胎鼠腭突间充质细胞中的定位和表达,蛋白质印迹法检测胎鼠腭突间充质细胞内Smad2、磷酸化Smad2(phospho-Smad2,p-Smad2)、Smad4、Smad7的蛋白表达,RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)验证MEG3与转化生长因子β受体Ⅰ(transforming growth factor-βreceptorⅠ,TGF-βRⅠ)的相互作用。结果与对照组相比,TCDD组GD13(t=6.66,P=0.003)和GD14(t=6.56,P=0.003)胎鼠腭突间充质细胞中BrdU阳性细胞率显著减少,但在GD15时BrdU阳性细胞率显著增加(t=-5.98,P=0.004)。原位杂交显示MEG3主要表达于间充质细胞的细胞核。RT-PCR结果显示,TCDD组腭突间充质细胞内的MEG3相对表达量显著高于对照组(GD13:t=39.28,P=0.012;GD14:t=18.75,P=0.042;GD15:t=28.36,P=0.045)。在GD14,TCDD组胎鼠腭突间充质细胞内p-Smad2、Smad4蛋白表达均显著低于对照组(p-Smad2:t=9.48,P=0.001;Smad4:t=63.10,P=0.001),Smad7蛋白表达量显著高于对照组(t=30.77,P<0.001)。RIP实验结果显示,TCDD组GD14胎鼠腭突间充质细胞中TGF-βRⅠ结合MEG3的表达量(23.940±1.301)显著高于对照组(8.537±1.523)(t=24.55,P<0.001)。结论TCDD可能通过促进MEG3与TGF-βRⅠ的靶向结合影响TGF-β/Smad信号途径的激活,从而抑制腭突间充质细胞的增殖,由此导致腭裂的发生。