Smad锚着蛋白在高糖诱导人肾小管上皮细胞细胞外基质沉积中的作用

目的:阐明Smad锚着蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)在高葡萄糖诱导的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2细胞)细胞外基质(ECM)沉积中的作用及分子机制,探讨以SARA为靶点抑制高葡萄糖诱导的HK-2细胞ECM沉积的策略。方法:用高浓度葡萄糖(30 mmol/L D-葡萄糖)刺激HK-2细胞,通过WesternBlot及实时定量PCR(Real-time PCR)检测纤维连接蛋白(FN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ),进而检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3的表达变化,通过细胞免疫荧光、Western Blot、Real-time PCR检测SARA的表达变化;分别转染全长SARA质粒[SARA(WT)]及敲除SBD结构域的SARA质粒[SARA(dSBD)],检测转染后高糖诱导HK-2细胞FN及ColⅠ表达的变化。结果:Western Blot及Real-time PCR结果显示,30mmol/L D-葡萄糖刺激后,HK-2细胞ColⅠ赁白及mRNA表达呈时间依赖性升高。高糖可诱导TGF-β1、Smad3蛋白及其mRNA表达呈时间依赖性上调;Smad2 mRNA表达呈时间依赖性上调,而其蛋白表达呈时间依赖性下调;高糖可促进Smad2和Smad3磷酸化,但Smad3的活化时间更长。而SARA的蛋白及mRNA表达呈时间依赖性降低,细胞免疫荧光结果亦汪实高糖刺激后SARA表达下降。与高糖组相比。转染SARA(WT)可使HK-2细胞FN和ColⅠ表达下凋;转染SARA(dSBD)对高糖诱导的HK-2细胞FN和ColⅠ表达无明显影响。结论:高糖诱导的HK-2细胞ECM沉积过程中,TGF-β1信号通路活化,SARA的表达下凋;过表达SARA可能通过上调Smad2的蛋白表达,抑制TGF-β1信号传导,从而减少高糖诱导的HK-2细胞ECM分泌。

Smad锚着蛋白的结构和功能

SARA是Smad锚着蛋白,可与Smad2/3直接结合,募集Smad2/3至TGF-β受体,是TGF-β信号通路中重要的衔接蛋白。SARA通过改变Smad2和Smad3的活化水平调节TGF-β信号转导,在Smad2的活化中起至关重要的作用。SARA也能与蛋白磷酸酶1的催化亚单位(PP1c)相结合,参与Smad7介导的TGF-βI型受体(TβR-I)去磷酸化。SARA的表达水平与上皮细胞转分化及纤维化的程度密切相关,参与上皮细胞转分化的调控。靶向SARA的干预策略是治疗TGF-β介导的上皮细胞转分化及纤维化的新路径。

Smad锚着蛋白在糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化中的作用及机制研究

目的研究Smad锚着蛋白（SARA）在高葡萄糖诱导的HK-2细胞转分化中的作用及相关机制。方法用高浓度葡萄糖（30mmol／LD．葡萄糖）刺激HK-2细胞，分别采用细胞免疫荧光、Western印迹及实时定量PCR等方法检测HK-2细胞波形蛋白（vimentin）、紧密连接蛋白（ZO-1）、SARA、转化生长因子p1（TGF-β1）、Smad2及Smad3的表达。分别转染全长SARA质粒[SARA（wT）]及敲除SBD结构域的SARA质粒[SARA（dSBD）]，检测转染后高糖诱导的HK-2细胞Vimentin、ZO-1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达的变化。结果高糖刺激时，HK-2细胞出现转分化；ZO．1蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调；vimentin蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调，而SARA蛋白和mRNA表达呈时间依赖性下调；TGF-61、Smad3蛋白和mRNA表达呈时间依赖性上调；Smad2mRNA表达呈时间依赖性上调，而其蛋白表达呈时间依赖性下调；Smad2和Smad3磷酸化，Smad3活化时间更长。与高糖刺激组相比，转染全长SARA质粒[SARA（wT）]过表达SARA使HK-2细胞ZO-1表达上调（P〈0．05）；vimentin表达下调（P〈0．05）；Smad2蛋白表达上调，但mRNA表达无明显变化；Smad2活化时间延长。转染SARA（dSBD）质粒对高糖诱导的HK-2细胞ZO．1、vimentin、Smad2的表达无影响，对Smad2和Smad3的磷酸化亦无明显影响。结论高糖诱导的HK．2细胞转分化过程中，TGF-β1信号通路活化，SARA的表达下调。过表达SARA可能通过上调Smad2的蛋白表达，延长Smad2活化时间，从而抑制TGF-β1信号传导，进而抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化进程。

大鼠肝纤维化病理过程中Smads锚着蛋白表达变化

目的观察肝纤维化病理过程中肝脏Smads锚着蛋白(SARA)的表达变化及其与肝纤维化的关系。方法大鼠每kg体重10μl二甲基亚硝胺腹腔注射,1次/d,每周连续3 d,共4周,复制大鼠肝纤维化模型。模型大鼠分别设首次造模后1、3 d、1,2、3、4周末,与造模停止后1、2、4周,共9个时间段为观察组。每组5～8只,另设正常大鼠10只为对照组。天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积,盐酸水解法测定肝组织羟脯氨酸(HYP)含量,免疫组织化学染色观察肝组织SARA蛋白表达,Western blot法分析肝组织转化生长因子(TGF)β1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和SARA蛋白的表达,并进行以上指标的相关性分析。结果随二甲基亚硝胺染毒持续,模型大鼠肝脏胶原增生(Hyp含量)与沉积增加,4周末时达到高峰,可见宽大纤维间隔与假小叶；而后随染毒停止,肝脏胶原沉积与纤维间隔有所减轻。模型组4、5、6、8周肝组织Hyp平均含量(μg/g)分别为193．0±39．2、188．5±39．9．174．4±21．2、163．6±31．5,对照组分别为125．6±19．5,t值在3．43～4．9,P值均＜0．01。免疫组织化学染色发现,SARA主要表达于正常与纤维化肝脏的肝窦周围间质细胞,随肝纤维化发展SARA阳性染色细胞数量减少,随染毒停止与肝纤维化恢复,SARA渐恢复至正常组水平。Western blot发现,随肝纤维化形成,模型大鼠肝组织TGFβ1、α-SMA蛋白表达逐渐增加,而SARA蛋白表达逐渐减少；肝纤维化恢复过程中,SARA渐恢复接近正常水平,TGFβ1与α-SMA蛋白表达有所下降。在肝纤维化形成与恢复过程中,SARA蛋白与Hyp含量、TGFβ1与α-SMA表达均呈明显负相关。结论SARA蛋白主要表达于肝脏间质细胞；随大鼠肝纤维化发展,SARA表达减少,SARA蛋白与肝纤维化形成呈负相关关系。

SARA在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的表达变化

目的:建立高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化模型,检测肾小管上皮细胞转分化过程中Smad锚着蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)的表达变化。方法:采用Western印迹和实时定量PCR检测细胞波形蛋白(vimentin)、紧密连接蛋白(Zona occludens-1,ZO-1)、SARA蛋白及其mRNA表达水平。结果:30mmol/LD-葡萄糖刺激后,HK-2细胞vimentin蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性升高,而ZO-1蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性下降,此变化在高糖刺激48h时最为显著。同时,SARA蛋白及其mRNA表达水平呈时间依赖性下降。结论:高糖可诱导HK-2细胞发生转分化,SARA可能作为保护因子参与了这一过程。