牦牛SMAD1基因第1外显子SNPs检测及与生长性状的关联分析

研究牦牛SMAD1基因第1外显子SNPs与生长性状的关系,寻找与牦牛生长性状相关的分子标记。采用DNA测序和单倍型分型技术,对青海牦牛SMAD1基因进行SNPs检测及其基因分型、连锁不平衡和单倍型分析,并对多态位点的基因型及组合单倍型与牦牛生长性状的关联性进行分析。结果发现,SMAD1在第1外显子上存在5个突变位点,其中,g.35084C>T、g.35111C>T和g.35333G>A均存在2种基因型,g.35171G>A和g.35312C>T均存在3种基因型。连锁不平衡分析发现5个位点间不存在强的连锁不平衡效应,单倍型分析发现存在6种不同的单倍型,其中单倍型Hap3的发生频率最高。关联性分析表明,g.35084C>T位点与胸围显著相关,g.35111C>T位点与体斜长、胸围显著相关,g.35171G>A和g.35312C>T位点与体质量、体高、体斜长和胸围显著相关,g.35333G>A位点与胸围、体高显著相关。通过基因型组合发现,4种组合单倍型均与牦牛生长性状有着显著或极显著相关,且H3H6可能是影响牦牛生长性状的最优组合单倍型。综上所述,牦牛SMAD1基因第1外显子多态性丰富,且与部分生长性状显著关联,可作为牦牛分子标记辅助选择的候选基因。

SMAD1基因在策勒黑羊卵巢不同生理期差异表达及生物信息学分析

本研究以SMAD1基因为研究对象,对策勒黑羊卵巢黄体期、卵泡期、妊娠期30 d进行荧光定量分析,寻找SMAD1基因表达量的规律,探索策勒黑羊常年发情的分子机制。通过生物信息学方法对策勒黑羊SMAD1基因理化性质进行预测和分析。结果发现:SMAD1基因在妊娠期30 d表达量最高,极显著高于黄体期和卵泡期,其表达量依次为妊娠期30 d>卵泡期>黄体期;绵羊SMAD1基因位于17号染色体,核心启动子在1 912~1 962 bp,没有CpG岛;SMAD1基因编码464个氨基酸,丝氨酸(Ser)所占比例最高为10.6%;不稳定指数为60.55,为不稳定亲水性蛋白;该蛋白定位于细胞核,无跨膜结构区域;主要的二级结构元件是由α-螺旋结构和无规则卷曲组成;进化树分析发现,绵羊和牛蛋白亲缘关系最近,同源性达100%。本研究为策勒黑羊常年发情和高繁殖力的选育提供了理论基础。

SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响

【目的】为了探索秦川牛(Bos taurus)SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1(NM_001077107.2)已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列si SMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-b SMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-b SMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列si SMAD1和过表达腺病毒AD-b SMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%(诱导1d,P<0.01)、66.7%(诱导3d,P<0.01)、60.0%(诱导6d,P<0.01)、54.7%(诱导9d,P<0.01)。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10^(10)pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-b SMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-b SMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍(诱导1d)、3.19倍(诱导3d)、105.3倍(诱导3d),P<0.01)和144倍(诱导9d,P<0.01);结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列si SMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。

下调Smad1基因抑制RA-FLS侵袭和迁移

目的 探讨Smad1基因对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞侵袭和迁移的影响及机制.方法 将Smad1 siRNA转染MH7A细胞,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测干涉效率.Western blot法检测各组细胞中上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和MMP-13表达水平,Transwell实验分析MH7A细胞侵袭和迁移能力.结果 转染Smad1 siRNA可有效抑制MH7A细胞中Smad1 mRNA和蛋白的表达.抑制Smad1的表达后,α-SMA和vimentin表达水平显著下调,E-cadherin的表达明显上调;MH7A细胞上皮间质转化(EMT)过程受到阻碍,侵袭和迁移能力均受到抑制,MH7A细胞中MMP-3和MMP-13表达降低.结论 下调Smad1基因表达,可降低MMP-3和MMP-13的表达水平,进而阻碍EMT的发生,抑制MH7A细胞的体外侵袭和迁移.

绵羊SMAD1基因组织表达及其多态性与产羔数关联分析

【目的】绵羊产羔数是一个极其复杂的性状,受诸多因素影响。绵羊排卵数是最重要的因素之一,而SMAD蛋白在哺乳动物卵泡发育和颗粒细胞生长分化过程中发挥着重要作用。因此本文基于前期绵羊基因组重测序数据,深入研究SMAD家族成员1 (SMAD family member 1, SMAD1)基因在不同繁殖力小尾寒羊组织表达模式,并探讨其多态性与绵羊产羔数的关系,以揭示其影响产羔数的机制,为绵羊分子育种提供科学依据。【方法】首先,采用反转录PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊群体大脑,小脑,下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管,心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,肾上腺,甲状腺,大肠,小肠,胰腺,瘤胃,肾脂19种组织的表达模式,然后利用实时荧光定量PCR技术检测SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊下丘脑,垂体,子宫,卵巢,输卵管5种繁殖组织的相对表达量。随后采用Sequenom MassARRAY?SNP技术对SMAD1基因5个单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)位点在小尾寒羊(n=380)、湖羊(n=101)、苏尼特羊(n=21)、草原型藏羊(n=161)、策勒黑羊(n=52)、滩羊(n=22)6个绵羊品种中进行基因型检测,计算其群体遗传学指标,利用SPSS19.0软件分析5个SNPs与小尾寒羊产羔数的相关性。【结果】PCR结果显示,SMAD1基因在不同繁殖力小尾寒羊全身性组织均有表达,在小尾寒羊单羔群体卵巢的表达量极显著高于多羔群体(P<0.01),小尾寒羊单羔群体下丘脑、垂体的表达量显著高于多羔群体(P<0.05);基因分型结果表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A和g.12487190G>T位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异显著(P<0.05);而g.12508874T>C和g.12487467A>G位点在单、多羔绵羊品种中基因型和等位基因频率均差异不显著(P>0.05);群体遗传学分析表明,g.12485895A>G、g.12487558G>A、g.12508874T>C、g.12487467A>G、g.12487190G>T位点在小尾寒羊、湖羊、策勒黑羊、苏尼特羊、草原型藏羊中均为中度多态(0.25<PIC<0.5),g.12508874T>C位点在滩羊群体表现为低度多态(PIC<0.25);卡方适合性检验表明,g.12485895A>G和g.12487467A>G位点在小尾寒羊和草原型藏羊中处在Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05),g.12487558G>A在小尾寒羊和湖羊群体处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05),g.12487190G>T位点在草原型藏羊处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)。其他位点在6个绵羊品种中均处在Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05);关联分析表明,g.12485895A>G,g.12487558G>A,g.12508874T>C和g.12487467A>G位点与小尾寒羊产羔数无显著关联。g.12487190G>T位点TT基因型母羊前三胎的产羔数均显著高于GT和GG基因型母羊(P<0.05)。将该位点与小尾寒羊FecB(A746G)不同基因型进行组合后发现,AA-GG、AA-GT、AA-TT型母羊产羔数显著低于其他组合基因型母羊(P<0.05)。【结论】SMAD1与小尾寒羊繁殖密切相关,g.12487190G>T可作为小尾寒羊产羔性状选育的潜在分子标记。

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P<0.01),输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组(P<0.05),其他组织未达到差异显著性(P>0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P<0.05),P4含量在12 h显著高于对照组(P<0.05);超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用(P<0.05),48、72 h达到极显著促进作用(P<0.01),并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低(P<0.01)。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。

Smad1基因在敖汉细毛羊发情不同时期卵巢中的表达规律研究

为了探索Smad1 mRNA及其蛋白在敖汉细毛羊不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,试验采用实时荧光定量PCR、免疫组化方法分析绵羊不同繁殖状态下(乏情期、发情间期、发情前期、发情期)Smad1基因在卵巢中mRNA表达量的变化规律及卵巢中该基因蛋白的表达,并进行图像分析。结果表明:发情期Smad1基因表达量最高,极显著高于其他三个时期(P<0.01);发情前期Smad1基因表达量显著高于乏情期和发情间期(P<0.05)。在绵羊不同发情时期Smad1蛋白主要表达于乏情期原始卵泡、次级卵泡的颗粒细胞、发情间期次级卵泡的卵泡膜细胞,在发情前期与发情期卵泡中未见表达。卵巢中Smad1基因可能促进黄体溶解,对卵泡发育、卵子的成熟以及释放起作用,与绵羊发情的启动有一定关系。

散发性先天性心脏病相关SMAD1基因新突变研究

目的:研究散发性先天性心脏病相关SMAD1基因新突变。方法:入选202例散发性先天性心脏病患儿和238名健康者,收集其临床资料和血标本并常规抽提基因组DNA,测序分析SMAD1基因以发现致病新突变。克隆SMAD1基因,构建野生型SMAD1表达载体SMAD1-pcDNA3.1,通过定点诱变产生突变型SMAD1-pcDNA3.1,转染COS7细胞,应用双荧光报告基因分析试剂研究突变的功能特性。结果:在1例散发性先天性右心室双流出道合并室间隔缺损患儿中发现SMAD1基因新突变,即NM_005900.3:c.381T>A;p.(Cys127^(*))突变。该突变不存在于238名健康者中。报告基因分析表明突变型SMAD1对靶基因TBX20的转录激活作用丧失。结论:SMAD1基因功能丧失性突变可能是部分散发性先天性右心室双流出道合并室间隔缺损的分子病因,这对先天性心脏病的精准医学防治具有潜在意义。

肝纤维化不同证型与TGF-β_1/Smad基因蛋白表达关系的实验研究

目的:观察肝纤维化不同证型与TGF-β1/Smad基因蛋白的关系。方法:分别设立正常对照组、单纯肝纤维化组、肝纤维化肝郁脾虚证组和气虚血瘀证组,各模型组先用CCl4注射法复制肝硬化疾病模型,然后肝郁脾虚证组附加夹尾和大黄灌胃法、气虚血瘀证组附加游泳疲劳法,并以相应药物干预。采用免疫组化法测定肝组织TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3及Smad7水平,用比色法测定肝组织Smad3 mRNA。结果:TGF-β1、TβR-Ⅰ、Smad2/3和Smad7在模型对照组中表达明显增强,以肝纤维化气虚血瘀组最为显著,肝纤维化肝郁脾虚组和单纯肝纤维化组的表达面积和强度相似。各模型组Smad3 mRNA呈上调表达,差异均具有十分显著的意义(P<0.01),以气虚血瘀组升高最明显,单纯肝纤维化组与肝郁脾虚组比较差异无显著性意义。结论:TGF-β1/Smad信号转导通路参与了肝纤维化的发生发展,肝纤维化不同证型之间TGF-β1/Smad基因蛋白表达有差异。

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。

TGF-β／Smad信号通路中TGF—β1和Smad7基因在结肠癌中的表达

目的通过检测TGF—β／Smad信号通路中的TGF—β1及Smad7基因在结肠癌癌组织中的表达，探讨的关系研究它们与结肠癌发生、发展的关系。方法本研究以人结肠癌病例标本作为研究对象，采用免疫组化S-P二步法对40例不同时期结肠癌组织检测。结果TGF—β1在结肠癌阳性率为70％（26／40），smad7在结肠癌阳性率为75％（28/40），不同性别、年龄中二者表达无统计学意义（P〉0．05），在淋巴结转移、分化程度、Dukes分期相关差异有统计学意义（P〈0．05），两者有相关性。结论TGF—β1和Smad7在结肠癌发生、发展中具有重要协同作用。可作为结肠癌诊断的辅助指标。

Smad1在鹅胚胎期皮肤毛囊的表达及分布规律分析

以豁眼鹅为研究对象,采用荧光定量PCR方法研究Smad1基因mRNA在鹅胚胎期13,18,28 d(E13、E18和E28)3个时间点表达趋势的变化;利用苏木精-伊红染色法(HE染色,Hematoxylin-eosin staining)结合免疫组织化学染色(IHC染色,Immunohistochemistry staining)对皮肤组织进行常规及特异性染色观察。荧光定量PCR结果显示,Smad1基因mRNA相对表达量在E13、E18、E28这3个时间点呈现下降趋势,其中E13与E18相对表达量差异显著(P<0.05),E13与E28相对表达量差异极显著(P<0.01),E13皮肤组织中Smad1基因mRNA相对表达量约为E28组织中表达量的3倍。HE染色和IHC染色结果显示,在E13的组织中,SMAD1主要分布于整个皮肤组织中,包括未分化的真皮与表皮以及真皮凝集体;至E18,SMAD1仍可见于皮肤及毛囊组织,但在毛囊底部呈现阴性状态;E28时,SMAD1阳性表达主要集中于表皮及毛囊周围,其他部位表达明显减少。结果表明:Smad1在鹅胚胎期毛囊发育分化过程中具有潜在的调控作用。

SMAD1通过调控miR-32表达影响结直肠癌细胞增殖、凋亡和迁移

目的:研究SMAD家族成员1(SMAD family member 1,SMAD1)通过调控微RNA(microRNA,miRNA,miR)-32对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞增殖、凋亡和迁移等生物学行为的影响,并探讨可能的作用机制。方法:实时荧光定量PCR法检测SMAD1在CRC细胞HCT-8、HCT-116和HT-29以及正常结肠上皮细胞株NCM460中的表达水平。采用脂质体法分别将特异性针对SMAD1基因的si RNA(siSMAD1)和si RNA-阴性对照(negative control,NC)(siNC)转染至人CRC细胞HCT-116中,用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测沉默效果。分别采用CCK-8法、FCM法、划痕愈合实验和Transwell小室实验检测沉默SMAD1表达对细胞增殖、凋亡和迁移的影响;实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测沉默SMAD1表达对HCT-116细胞中miR-32及其宿主基因TMEM245及靶基因PTEN表达的影响;实时荧光定量PCR法检测上皮-间质转化相关因子波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)mRNA的表达水平。采用染色质免疫共沉淀法检测SMAD1是否能直接与TMEM245/miR-32的启动子区相结合。分别将miR-32-模拟物(miR-32-mimics)以及阴性对照-模拟物(NC-mimics)转入HCT-116细胞,采用实时荧光定量PCR法检测转染效率和SMAD1的表达水平。分别同时共转染siSMAD1+miR-32-mimics以及siSMAD1+NC-mimics至HCT-116细胞,采用CCK-8法、FCM法、划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测共转染后细胞增殖、凋亡和迁移能力的改变,实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染后对PTEN和上皮-间质转化相关因子表达的影响。结果:CRC细胞HCT-8、HCT-116和HT-29中SMAD1 mRNA的表达水平均高于正常结肠上皮细胞株NCM460细胞(P均<0.05)。siSMAD1转入HCT-116细胞后,HCT-116细胞中SMAD1 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调(P均<0.05)。沉默SMAD1基因表达后,HCT-116细胞的增殖和迁移能力均被抑制,而凋亡率明显增加(P均<0.05),miR-32和TMEM245 mRNA的表达水平下调,PTENmRNA和蛋白表达水平上调(P均<0.05),Vimentin和N-cadherin mRNA的表达下调,E-cadherin mRNA表达上调(P均<0.05)。染色质免疫共沉淀结果显示,SMAD1能与TMEM245/miR-32核心启动子区相结合(P<0.05)。与siSMAD1+NC-mimics共转染组相比,siSMAD1+miR-32-mimics共转染组细胞增殖、迁移能力增强,凋亡率减少,PTEN蛋白表达水平下调,Vimentin和N-cadherin mRNA的表达上调,E-cadherin mRNA表达下调(P均<0.05)。结论:沉默SMAD1表达可通过下调miR-32表达来上调PTEN的表达水平,进而抑制CRC细胞的增殖和迁移能力,促进细胞凋亡。