Smad7,Smad3和Smad2在DEHP诱导的尿道下裂大鼠阴茎中的表达

目的研究Smads(7,3和2)在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)]诱导的尿道下裂大鼠阴茎组织中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠随机分为2组:实验组(将DEHP溶于1.5 mL大豆油中灌胃大鼠)和对照组(以1.5 mL大豆油灌胃大鼠),每组20只,自孕12 d(gestation day,GD12)至19 d(GD19)连续每天定时给药1次。至GD20行剖宫产取出雄性胎鼠,切取阴茎组织,采用实时定量PCR和免疫组化法分别检测胎鼠阴茎中Smad7,Smad3和Smad2三者mRNA和蛋白质表达水平。结果经qP CR检测分析后发现,Samd7,Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别为<0.001,0.041和0.021);观察实验组Smad7和p-Smad2/3蛋白表达水平亦有增加趋势。结论DEHP诱导的先天性尿道下裂可能与胎鼠阴茎组织中Smads(7,3和2)的过度表达有关。

银屑病患者皮损中转化生长因子-β_1、-β_1受体及其信号转导蛋白Smad2、3的表达

目的:观察银屑病患者皮损与正常人皮肤中T细胞转化生长因子(TGF)-β_1、TGF-β_1受体(TGF-β_1R I、TGF—β_1RⅡ)及其信号转导蛋白Smad2、3的表达,分析TGF—β_1信号转导通路在银屑病发病机制中的作用。方法:采用Real-time PCR(RTPCR)法检测20例银屑病患者皮损及10例正常人皮肤中TGF—β_1、TGF—β_1受体(I、Ⅱ)、Smad(2、3)mRNA的表达,用western blot杂交法检测TGF—β_1、Smad2、3的表达。结果:银屑病患者皮损中TGF—β_1、TGF—β_1R I、TGF—β_1RⅡ及其信号转导蛋白smad2、3的mRNA表达明显低于正常对照组(P<0.01),TGF—β_1和Smad2、3的蛋白表达明显低于正常对照组(P<0.01)。结论:T细胞TGF-β1信号转导通路的低表达可能有助于银屑病患者表皮过度增殖状态的发生和发展。

TGF-β、Smad信号通路蛋白及α-SMA在糖尿病肾病患者肾组织中的表达和意义

目的检测转化生长因子(TGF)-β、Smad信号通路蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在糖尿病肾病(DN)患者肾活检组织中的表达,探讨DN的发病机制。方法收集DN肾组织标本28例(DN组);非DM行肾切除的正常肾组织10例为对照组。应用免疫组化方法检测TGF-β1、TGF-β受体(R)Ⅰ、TGF-βRⅡ、Smad2/3、α-SMA在肾组织中的表达。结果 (1)TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2/3在DN组和对照组中均有表达,前者高于后者,DN组早期光镜下肾组织未见明显异常时即有明显的高表达,而随着疾病的进展未见表达增高的现象。肾小球、肾小管出现纤维化后并不表达上述因子。(2)对照组的α-SMA仅表达于肾血管、肾小球和肾小管,而肾间质未见α-SMA表达,而DN组α-SMA在上述组织中均有表达。结论TGF-β及Smad信号转导通路参与了DN的发病,DN可能与免疫复合物性肾小球肾炎具有相似的发病机制。

慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路被秋水仙碱的抑制

背景:胰腺星状细胞内转化生长因子β1/Smads信号通路活化可能是导致胰腺组织纤维化的主要分子学机制。如能阻断这一通路,就可能抑制慢性胰腺炎组织的纤维化进程。目的:探讨秋水仙碱对慢性胰腺炎模型大鼠转化生长因子β1/Smads通路的抑制作用。方法:健康雄性SD大鼠随机分为慢性胰腺炎组及秋水仙碱干预组,慢性胰腺炎造模成功后,秋水仙碱干预组大鼠每日腹腔内注射秋水仙碱150μg/kg,慢性胰腺炎组则每日腹腔内注射等体积的生理盐水。3个月后取胰腺组织,苏木精-伊红染色观察胰腺组织的病理学改变,免疫组化观察胰腺组织转化生长因子β1表达,Western blot法测定胰腺星形细胞内P-Smad2、P-Smad3、α-SMA蛋白表达水平。结果与结论:苏木精-伊红染色结果显示:与秋水仙碱干预组相比,慢性胰腺炎组胰腺组织内腺体组织减少,而纤维结缔组织、炎细胞明显增多并取代胰腺腺体组织。免疫组化结果显示:秋水仙碱干预组胰腺组织内转化生长因子β1阳性表达级别和阳性细胞指数显著低于慢性胰腺炎组(P<0.05)。Western blot结果显示:慢性胰腺炎组胰腺星形细胞内P-Smad2/β-actin、P-Smad3/β-actin、α-SMA/β-actin表达明显低于秋水仙碱干预组(P<0.05)。结果提示秋水仙碱可以抑制慢性胰腺炎大鼠转化生长因子β1/Smads信号通路及胰腺组织纤维化。因此,秋水仙碱可作为治疗慢性胰腺炎纤维化的一种新的候选方案。

Lefty蛋白拮抗人肾小管上皮细胞凋亡的研究

目的 探讨Lefty蛋白对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡的影响。方法采用脂质体将人Lefty质粒转染入离体培养的HK-2细胞，使其稳定表达Lefty蛋白。对正常对照组（A组）和Lefty转染组（B组）细胞给予10ng／mlTGF-β1刺激后，采用Westernblot法检测各组细胞第6、12、24、48小时磷酸化Smad2／3（p-Smad2／3）表达水平，并同时采用流式细胞术检测各组细胞凋亡程度。结果TGF131刺激后，A组p-Smad2／3表达水平和细胞凋亡程度较刺激前升高（P〈0．05），而B组上述指标均低于A组（P〈0.05）。结论Lefty蛋白可拮抗TGF-19J／Smad信号转导通路，减轻TGF-β1介导的人肾小管上皮细胞凋亡。

血清素促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成

目的探讨血清素对成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的影响。方法用不同浓度（50、100、200和400ng／L）的血清素处理人成骨细胞，即时定量PCR（RT—PCR）观察成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白和赖氨酰氧化酶（LOX）含量的变化。用LOXsiRNA干扰LOX蛋白的表达后，用Western blot法检测干扰效果，用酶联免疫吸附实验检测Ⅰ型胶原蛋白含量的变化。用RT—PCR检测血清素处理成骨细胞后Smad2蛋白、Smad3蛋白表达量的变化和Smad3基因敲除对LOX蛋白表达的影响。结果血清素上调成骨细胞中Ⅰ型胶原蛋白和LOX的表达水平，LOXsiRNA可显著抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达。此外，血清素上调了成骨细胞中Smad2蛋白和Smad3蛋白的表达，干扰Smad3基因的转录，抑制LOX蛋白的表达。结论血清素通过Smad信号通路上调LOX的表达，并促进成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成。

成人真皮成纤维细胞中转化生长因子β1转录调控Meox1的机制及对细胞迁移的影响

目的探讨成人真皮成纤维细胞(HDF-a)中转化生长因子β1(TGF-β1)对Meox1的转录调控机制及细胞迁移功能的影响。方法(1)取HDF-a系细胞,用RPMI 1640完全培养基培养(下称常规培养),将细胞分为TGF-β1刺激组和空白对照组。TGF-β1刺激组细胞加入10μL质量浓度为1 mg/μL的TGF-β1刺激,空白对照组加入等量磷酸盐缓冲液。培养72 h,取2组部分细胞进行转录组测序,筛选出2组差异表达比值≥2且P<0.01的基因,对差异基因进行功能富集分析与京都基因和基因组百科全书代谢途径分析,记录Meox1每百万转录本(TPM)表达值,样本数为3;取2组部分细胞,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测Meox1 mRNA表达,样本数为3。(2)取对数生长期HDF-a系细胞(细胞生长期下同)常规培养,分为空质粒组和Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组,分别转染2μg pcDNA3.1空质粒和各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒,转染6 h后常规培养48 h,实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞中Meox1 mRNA的表达,样本数为3。(3)取HDF-a系细胞常规培养,同实验(1)分组处理,常规培养72 h,采用染色质免疫共沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)法检测2组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度,样本数为3。(4)取HDF-a系细胞常规培养,分为阴性干扰组、小干扰RNA(siRNA)-Smad2组、siRNA-Smad3组、siRNA-Smad4组和空质粒组、Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组,分别转染50μmol/L随机siRNA、siRNA-Smad2、siRNA-Smad3、siRNA-Smad4和2μg pcDNA3.1空质粒及各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒,转染6 h后常规培养48 h,ChIP-qPCR法检测相应组别细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度,样本数为3。(5)取2个批次HDF-a系细胞常规培养,均分为阴性干扰组、siRNA-Meox1组、空质粒组、Meox1过表达组,分别转染50μmol/L随机siRNA、siRNA-Meox1和2μg pcDNA3.1空质粒、搭载Meox1的pcDNA3.1质粒,转染6 h后常规培养24 h,1个批次细胞进行划痕实验,划痕后24 h观察划痕宽度,与划痕后即刻对比划痕愈合宽度;1个批次细胞进行Transwell实验,常规培养24 h,计数迁移细胞,样本数为3。(6)2018年1月—2019年6月,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院收治3例烧伤后8~12个月增生性瘢痕患者(男2例、女1例,年龄35~56岁),取其术中切除的瘢痕组织和瘢痕边缘附带正常皮肤组织,行免疫组织化学染色,观察Meox1蛋白表达分布。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验。结果(1)培养72 h,2组细胞差异表达明显的基因共843个,涉及组织修复、细胞迁移、炎性细胞趋化诱导过程等功能以及肿瘤坏死因子、白细胞介素17、细胞外基质受体等潜在的信号通路;空白对照组细胞测序结果的Meox1 TPM表达值为45.9±1.9,显著低于TGF-β1刺激组的163.1±29.5(t=6.88,P<0.01)。培养72 h,空白对照组细胞Meox1 mRNA表达量为1.00±0.21,显著低于TGF-β1刺激组的11.00±3.61(t=4.79,P<0.01)。(2)培养48 h,Smad2过表达组、Smad3过表达组和Smad4过表达组细胞中Meox1 mRNA表达量分别为198.70±11.02、35.47±4.30、20.27±2.50,均显著高于空质粒组的1.03±0.19(t=31.07、13.80、13.12,P<0.01)。(3)培养72 h,TGF-β1刺激组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度均显著高于空白对照组(t=12.99、41.47、29.10,P<0.01)。(4)培养48 h,阴性干扰组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200000±0.030000)%,显著高于siRNA-Smad2组的(0.000770±0.000013)%(t=11.67,P<0.01);空质粒组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200000±0.040000)%,显著低于Smad2过表达组的(0.700000±0.090000)%(t=8.85,P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.5000±0.0413)%,显著高于siRNA-Smad3组的(0.0060±0.0013)%(t=17.79,P<0.01);空质粒组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.4700±0.0800)%,显著低于Smad3过表达组的(1.1000±0.0700)%(t=9.93,P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与siRNA-Smad4组相近(t=2.11,P>0.05),空质粒组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与Smad4过表达组相近(t=0.60,P>0.05)。(5)划痕后24 h,siRNA-Meox1组细胞划痕愈合宽度较阴性干扰组窄,Meox1过表达组细胞划痕愈合宽度较空质粒组宽。培养24 h,阴性干扰组迁移细胞数显著多于siRNA-Meox1组(t=9.12,P<0.01),空质粒组迁移细胞数显著少于Meox1过表达组(t=8.99,P<0.01)。(6)烧伤后增生性瘢痕患者瘢痕组织中Meox1蛋白表达明显高于正常皮肤组织。结论在HDF-a系细胞中,TGF-β1通过Smad2/3转录调控Meox1表达,进而促进细胞迁移。