转化生长因子胞内信号蛋白Smad2/3在糖尿病大鼠肾脏表达的动态观察及意义研究

目的:动态观察大鼠糖尿病肾病发生发展过程中TGF-β1及其下游信号分子Sm ad2/3在肾脏的表达及定位变化,探讨TGF-β1-Sm ad2/3信号通路在糖尿病肾病(DN)肾纤维化发病机制中的作用。方法:链脲菌素诱导大鼠糖尿病肾病,以免疫组化、W estern b lotting及荧光实时定量PCR(RT-PCR)的方法动态观察糖尿病肾病发生发展过程中大鼠肾脏TGF-β1、Sm ad2/3蛋白及mRNA表达,并以RT-PCR方法观察结缔组织生长因子(CTGF)、胶原-3(COL-Ⅲ)、纤溶酶原激活剂抑制因子-1(PAI-1)mRNA表达。结果:TGF-β1在糖尿病肾病(DN)大鼠肾小管表达明显多于正常组(P<0.05);Sm ad2/3蛋白主要以胞浆表达阳性为主,部分呈胞核表达阳性;Sm ad2/3蛋白及mRNA从2周起表达明显多于正常对照组(P<0.05),且随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势。16周DN组大鼠肾脏TGF-β1、Sm ad2、CTGF、COL-Ⅲ、PAI mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.05)。结论:TGF-β1-Sm ad2/3信号转导通路参与了糖尿病肾病肾脏纤维化形成的信号转导过程,伴随着Sm ad2/3信号蛋白表达的增多及入核增加,CTGF、COL-Ⅲ、PAI-1等基因转录增加,导致肾脏细胞外基质的大量沉积,这是细胞因子TGF-β1导致糖尿病肾病肾纤维化进展可能的信号转导途径之一。

鬼箭羽醇提取物通过阻止氧化应激和抑制TNF-α-NF-κB及TβR1-Smad2/3通路减轻兔肾缺血再灌注损伤

目的:探讨鬼箭羽乙醇提取物(EEEA)对家兔肾缺血再灌注损伤(RIRI)的作用及其机制。方法:将30只家兔随机分成正常组、模型组、低剂量EEEA(EEEA-L)组、高剂量EEEA(EEEA-H)组、地塞米松(Dex)组和联合治疗(Dex+EEEA-H)组,每组5只。各组动物分别灌胃药物24 h后,RIRI造模,再继续用相应药物灌胃13 d。其中,正常和模型组家兔灌胃等体积纯水,EEEA-L和EEEA-H组家兔分别灌胃0.156和0.623 g/kg EEEA,Dex组灌胃0.2 mg/kg Dex,Dex+EEEA-H组灌胃0.2 mg/kg Dex+0.623 g/kg EEEA,每天1次。分别于第0、7和14天耳缘静脉采血2 mL用于检测电解质、肾功能[血尿素氮(BUN)和血清肌酐(SCr)]、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素2/6(IL-2/6)、转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等。第14天采血后,以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳缘静脉麻醉,取出肾脏,病理学观察及肾组织Paller评分,RT-qPCR和Western blot检测转化生长因子β受体1(TβR1)、Smad2/3和核因子κB(NF-κB)P65的mRNA和蛋白表达。结果:EEEA各组血清K+、Cl−、BUN、SCr、IL-2/6、TGF-β_(1)、TNF-α和MDA水平及肾组织Paller评分均显著低于模型组,而SOD活性高于模型组(P<0.05),且这种作用高剂量显著强于低剂量(P<0.05);病理学也证实EEEA各组较模型组明显好转,较Dex+EEEA-H组肾小管扩张明显;EEEA各组的SOD和MDA水平与Dex+EEEA-H无显著差异(P>0.05);EEEA各组和Dex+EEEA-H组TβR1和NF-κB P65的mRNA和蛋白表达显著低于模型组(P<0.05),EEEA-H组与Dex+EEEA-H组无显著差异(P>0.05)。结论:EEEA对RIRI家兔的肾功能有保护作用,其机制可能与其多成分多靶位互补作用,阻止了氧化应激反应并抑制了TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3信号通路有关。

依那普利对单侧尿路梗阻大鼠肾组织Smad2/3活性的影响

目的：研究血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）依那普利对单侧尿路梗阻大鼠肾组织Smad2／3信号蛋白活性的影响。方法：采用单侧输尿管结扎（UUO）模型，治疗组从造模前24h至造模后28d以依那普利10 mg·kg^-1·d^-1灌胃，另设假手术组作正常对照。分别于造模后1，3，7，14，21和28d取肾组织，应用免疫组化法检测肾组织TGF-β1、磷酸化Smad2／3和α—SMA表达。结果：正常大鼠肾组织具有基础的TGF-β1（4.32±1.72）％和磷酸化Smad2／3（19．31±5.37）个／mm^2的表达，α—SMA只表达于血管平滑肌，肾小管-间质无表达。UUO术后1d，TGF-β1的表达无明显增加（5．15±2．08）％，第3d明显增加（13．55±6．33）％，第7d达高峰（26．78±8．77）％，此后表达减少；UUO术后3d，磷酸化Smad2／3的表达明显增加（67．95±13．87）个／mm^2，并持续增加到第7d（150．61±27．34）个／mm^2，此后表达减少；而UUO术后3d，肾组织α-SMA表达亦明显升高（5．58±1．23）％，第7d达到高峰（13．43±3．32）％，14d表达开始下调。依那普利治疗可以明显抑制肾组织TGF-β1信号蛋白Smad2／3活性（降低39％～55％，P〈0．01），显著下调肾组织α—SMA的表达（降低44％～58％，P〈0．01），减轻肾间质纤维化。结论：依那普利可显著抑制梗阻肾肾组织α—SMA的表达，减轻梗阻肾间质纤维化，这一作用可能与其抑制肾组织TGF-β1信号蛋白Smad2／3的活性有关．

糖尿病肾组织ανβ6整合素上调表达对TGFβ/Smads信号通路活化的影响

目的研究糖尿病小鼠肾组织αvβ6整合素的上调表达与TGFβ/Smads信号通路活化的关系,从分子水平探讨糖尿病肾病肾纤维化的发生机制。方法取雄性C57BL/6小鼠36只,分为模型组(30只)和对照组(6只)。模型组采用链脲左菌素[STZ50mg/(kg·d)]连续5d腹腔注射诱导糖尿病肾病模型,对照组用枸橼酸缓冲液腹腔注射。以血糖超过16.7mmol/L为糖尿病模型,观察时间为16周,分别在造模后0、4、8、12和16周处死检查。检测血糖、血肌酐、24h尿白蛋白排泄率、肾重/体重、肾小球体积;用免疫组织化学法检测肾组织αvβ6整合素、TGFβ及磷酸化Smad2/3的表达。结果腹腔注射STZ后,模型组小鼠均出现明显的多食、多饮、多尿和体重下降等糖尿病症状,血糖明显升高,血肌酐水平一过性增高,24h尿白蛋白排泄率明显增加,肾重/体重比值增加,肾小球体积增大,肾小球细胞外基质明显增宽。正常肾组织有αvβ6整合素、TGFβ和磷酸化Smad2/3的基础表达分别为:(3.32±1.21)%、(5.26±2.35)%和(6.83±1.33)个/mm2,糖尿病形成后4周,肾组织αvβ6整合素、TGFβ及磷酸化Smad2/3的表达明显增高分别为:(7.78±2.59)%、(9.65±3.15)%和(17.83±4.33)个/mm(2P<0.01),并持续增加到12周分别为:(18.79±5.52)%、(15.63±5.38)%和(28.29±5.15)个/mm2,P<0.01。肾组织αvβ6整合素与TGFβ和磷酸化Smad2/3的表达时项一致,并呈明显的正相关(r1=0.86,r2=0.83,P<0.01)。结论αvβ6整合素的上调表达可能通过增强TGFβ/Smads信号通路活性促进糖尿病肾病肾纤维化的发生。

SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其意义

目的:动态观察核转录共抑制因子SnoN蛋白在糖尿病大鼠肾组织中的表达变化,探讨其在糖尿病肾病(DN)发病机制中的作用。方法:SD大鼠随机分为3组,分别为糖尿病2周(DM2)、4周(DM4)和8周(DM8)组,每组均设相应的正常对照,链脲佐菌素(STZ)复制糖尿病大鼠模型;免疫组织化学法检测肾组织中SnoN、TGF-β1、Smad2/3、APC的表达;Western印迹法检测肾皮质SnoN蛋白的水平;生化方法测定血糖、血肌酐及24h尿蛋白量;光镜检查肾组织的形态改变。结果:Western印迹和免疫组化检测发现DM2大鼠肾组织中SnoN的表达与正常组相比差异无显著,DM4组明显减少(P<0.01),至8周时减少为正常对照组的42%。DM2组,大鼠肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad2/3、APC较正常组显著增多,并随病程进展而增加(P<0.01);DM4和DM8组,SnoN蛋白表达的减少与TGF-β1、Smad2/3、APC表达增多呈显著负相关(P<0.01)。结论:糖尿病大鼠肾脏TGF-β1表达增多,可能通过APC依赖的泛素化作用使SnoN蛋白降解,从而在DN的发病机制中起重要作用。

黄芪甲苷对MC3T3-E1细胞活性的影响及其机制探讨

目的:探讨黄芪甲苷对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1细胞活性的影响及其作用机制。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,用不同浓度的黄芪甲苷进行预处理后,MTT法测定细胞增殖情况,碱性磷酸酶法(ALP)测定细胞分化情况,Western blotting分析转化生长因子TGF-β1、成骨细胞信号转导蛋白Smad2/3表达水平;应用小干扰RNA(siRNA)转染法观察TGF-β1 siRNA对MC3T3-E1细胞增殖及活性的影响,加入抗Smad2/3抗体,探讨Smad2/3在黄芪甲苷介导的细胞增殖分化中的作用。结果:黄芪甲苷在一定浓度范围内剂量依赖性促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化能力。进一步机制分析表明,黄芪甲苷处理可诱导TGF-β1蛋白表达,TGF-β1siRNA处理后,黄芪甲苷诱导的MC3T3-E1细胞的增殖和分化能力明显下降;此外,黄芪甲苷可显著性诱导Smad2/3表达,经TGF-β1 siRNA处理后,黄芪甲苷诱导的Smad2/3表达显著下降;加入Smad2/3抗体后,黄芪甲苷诱导的MC3T3-E1细胞的增殖和分化能力明显下降。结论:黄芪甲苷可通过刺激TGF-β1-Smad2/3通路的活化促进成骨细胞的增殖和分化,从而有利于骨形成。因此,本研究将为骨折愈合的治疗提供新的研究方向。

基于“痰瘀生风”理论研究中药复方调控TGF-β1/Smad2/3/α-SMA信号通路治疗痰浊血瘀型PAF的机制研究

目的基于“痰瘀生风”理论,以转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad2/3/α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)信号通路为切入点探究中药复方抑制心房纤维化,改善痰浊血瘀型阵发性房颤大鼠心房重构的可能机制。方法将60只SD大鼠,随机分为对照组、模型组、中药复方高剂量组、中药复方中剂量组、中药复方低剂量组和维拉帕米组(n=10)。采用尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙(Ach-CaCl2)联合喂养高脂饲料方法建立痰浊血瘀型阵发性房颤大鼠模型,造模成功后,第2天开始灌胃,对照组及模型组采用等体积生理盐水灌胃,中药复方高剂量41.25g/(kg·d)、中剂量20.63g/(kg·d)、低剂量10.31g/(kg·d),日1次灌胃,维拉帕米组维拉帕米溶液25mg/(kg·d)日1次灌胃,用药干预2周后,心电图记录各组大鼠房颤持续时间、透射电镜观察大鼠心房肌组织超微结构,运用Western Blot法检测心房TGF-β1、Smad2/3、α-SMA蛋白表达。结果心电图显示造模成功,且与模型组相比,中药复方各剂量组及维拉帕米组大鼠房颤持续时间显著缩短(P<0.05);透射电镜下观察到心房肌细胞的肌小节轻微断裂,肌丝间未出现间隙;同时TGF-β1、Smad2/3、α-SMA表达显著下降(P<0.05)。结论中药复方可能通过调控TGF-β1/Smad/α-SMA通路相关蛋白的表达,抑制心房纤维化,改善心房重构,进而减少阵发性房颤的发生。

益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影响

目的 :探讨益气化瘀法中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β(TGF-β)/激活素受体样激酶(ALK)5/Smad蛋白2/3通路的影响。方法 :将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、糖尿病对照组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,运用Westernblot技术手段分别检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK5/Smad2/3的表达水平。结果:糖尿病对照组ALK5表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组ALK5表达水平明显低于糖尿病对照组(P<0.05),其与益气组、化瘀组、正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad2表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad2表达水平与各组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。糖尿病对照组smad3表达水平明显高于正常对照组(P<0.05);益气化瘀组smad3表达水平低于化瘀组(P<0.05),明显低于糖尿病对照组、益气组(P<0.01),高于正常对照组(P<0.05)。结论:糖尿病创面难以愈合及瘢痕形成的机制可能与ALK5/Smad2/3通路有关,益气化瘀中药可能通过抑制ALK5/Smad2/3通路,加速创面愈合,减少瘢痕形成。

侯氏黑散含药血清对氧糖剥夺损伤血管内皮细胞PLCγ2/ERK及TGF-β/Smad2/3表达的影响

目的探讨侯氏黑散含药血清对氧糖剥夺损伤人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中磷脂酶Cγ2(PLCγ2)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、转化生长因子β(TGF-β)及膜受体调控蛋白Smad2/3表达的影响。方法将HUVEC随机分为对照组,模型组,2.5%、5.0%、10.0%、20.0%侯氏黑散含药血清组。将模型组及各含药血清组细胞更换为无糖培养液后放入低氧培养箱连续培养6 h构建氧糖剥夺细胞模型,对照组正常培养相同时间。然后,对照组、模型组更换为含10.0%空白血清的完全培养基,各给药组用含对应质量分数的侯氏黑散含药血清正常培养24 h后提取细胞总蛋白。Western blot法检测细胞中PLCγ2、ERK、p-ERK、TGF-β及Smad2/3蛋白的表达。结果与对照组相比,模型组细胞PLCγ2、Smad2/3蛋白表达上调(P<0.01),TGF-β蛋白表达下调(P<0.01);与模型组比较,5.0%侯氏黑散含药血清上调TGF-β蛋白表达,2.5%、5.0%、10.0%侯氏黑散含药血清下调PLCγ2蛋白表达,各质量分数含药血清均下调Smad2/3的表达(P<0.01或P<0.05)。结论侯氏黑散含药血清可调节PLCγ2/ERK及TGF-β/Smad2/3信号通路,促进氧糖剥夺损伤的HUVEC增殖。

肾淋巴管结扎对单肾切除大鼠的肾损害作用

目的:探讨肾淋巴循环障碍及单侧肾脏切除对大鼠肾脏功能结构的损害。方法:雄性Wistar大鼠,随机分为3组:双肾淋巴管结扎组(2KL),左肾淋巴管结扎伴右肾切除组(1KL),假手术组(sham)。分别在术后1、2、4、8周每组各处死6只。测定24 h尿蛋白和血尿肌酐。用PAS和Masson染色观察肾组织病理改变。用RT-PCR检测TGF-β1、Smad2/3、I型胶原(col I)mRNA的表达量;用免疫组化和Western blotting方法检测组织col I、TGF-β1、Smad2/3和磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的蛋白表达量及主要表达部位。结果:2KL和1KL大鼠出现明显的蛋白尿和肾功能衰竭,1KL大鼠的肾脏损害尤其明显,随着时间推移逐渐加重,并出现明显的组织病理改变。2KL和1KL大鼠肾组织中col I、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的蛋白和(或)基因表达水平也明显增高(P<0.01),且主要表达在肾小管上皮细胞及肾间质。1KL大鼠的表达也明显高于2KL大鼠。结论:肾淋巴循环障碍可导致大鼠肾脏功能及小管间质的损害,并随时间而加重。当淋巴循环障碍伴对侧肾切除时,损害明显加重。

降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮细胞TGF-β_(1)/Smad信号通路的影响

目的探讨降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞凋亡的相关分子机制。方法制备降压通络方(1.42 g/mL灌胃大鼠)含药血清和缬沙坦(0.83 mg/mL灌胃大鼠)含药血清,采用缺氧诱导大鼠NRK-52E细胞凋亡模型,分为4组:正常组、模型组、降压通络方组和缬沙坦组。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力值,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞上清液转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))蛋白表达,免疫荧光法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白定位,Western Blot法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白表达。结果TGF-βRⅠ、Smad2/3在NRK-52E细胞上广泛表达。与正常组比较,模型组细胞活力值降低(P<0.01),凋亡率升高(P<0.01),TGF-β_(1)、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达升高(P<0.01)。与模型组比较,降压通络方组和缬沙坦组细胞活力值升高(P<0.01),凋亡率降低(P<0.05,P<0.01),TGF-β_(1)、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达降低(P<0.01,P<0.05)。与缬沙坦组比较,降压通络方组TGF-β_(1)表达升高(P<0.05),细胞活力值、凋亡率、TGF-βRⅠ和Smad2/3表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论降压通络方能抑制缺氧诱导的NRK-52E细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制TGF-β_(1)/TGF-βRⅠ/Samd2/3信号通路而实现。

肾复康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的影响及其机制研究

目的:探讨肾复康含药血清对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人肾小管上皮细胞株HK-2间质转化的影响及其分子机制。方法:以HK-2细胞作为研究对象,常规培养后将细胞进行如下分组及刺激处理:空白对照组、模型对照组(10 ng/ml TGF-β1刺激)、32 g/kg尿毒清30%含药血清组(30%尿毒清含药血清+TGF-β1刺激)、18.32 g/kg肾复康10%、30%含药血清组(10%或30%肾复康含药血清+TGF-β1刺激)。MTT法检测肾复康含药血清对HK-2细胞活力的影响;显微镜下观察各组细胞间形态学的差异;ELISA法检测各组细胞上清液中I型胶原(collagen I)和纤维连接蛋白(fibronectin)的水平;q-PCR法检测各组细胞内E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形纤维蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和整联蛋白连接激酶(ILK)基因的表达水平;蛋白免疫印迹法检测Smad2/3总蛋白、核蛋白表达及其磷酸化水平;蛋白免疫印迹法检测下游的ILK蛋白表达水平。结果:肾复康含药血清对HK-2细胞的存活率无抑制作用;与空白对照组比较,模型对照组细胞形态由上皮样的铺路石状变成间质样的长梭形,E-cadherin的mRNA水平显著下调(P<0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著上调(P<0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平显著上调(P<0.01);与模型对照组比较,肾复康各含药血清组E-cadherin的mRNA水平显著上调(P<0.01),Vimentin、α-SMA和ILK的mRNA水平显著下调(P<0.05或P<0.01),Smad2/3的蛋白磷酸化及核内水平明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论:肾复康能逆转TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞HK-2纤维化模型的上皮间质转化,其作用机制可能与其抑制胞内Smad2/3-ILK信号通路的活化有关。

中药颗粒对染矽尘大鼠肺组织TGF-β1/Smads 通路的调节作用

目的研究中药颗粒对染矽尘、Col-Ⅰ的影响,并从TGF-β1/Smads通路探讨其可能的作用机制。方法将SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和中药高、低剂量组,每组16只。对照组大鼠气管灌注1.0 ml生理盐水,其余组大鼠均给予1.0 ml 5%无菌SiO2悬浊液;造模后第2天开始给大鼠灌胃给药,1次/d,高剂量组、低剂量组大鼠分别灌胃1 000 mg/kg、500 mg/kg中药,对照组、模型组给予0.9%生理盐水。于灌胃第14、28天处死大鼠,并检测大鼠肺组织Col-Ⅰ、TGF-β1的含量及TGF-β1、Smad2/3蛋白的表达水平。结果造模后第14天和第28天,模型组大鼠肺组织Col-Ⅰ、TGF-β1含量高于对照组,中药干预后Col-Ⅰ、TGF-β1含量有所降低,不同剂量组间差异均具有统计学意义(P<0.05);模型组大鼠肺组织TGF-β1、Smad2/3及p-Smad2/3蛋白的表达水平高于对照组,中药干预后TGF-β1、Smad2/3及p-Smad2/3蛋白的表达水平有所降低,不同剂量组间差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论中药颗粒可以抑制SiO2诱导的大鼠肺组织Col-Ⅰ含量的升高,且该抑制作用可能与中药颗粒对大鼠肺组织TGF-β1/Smads通路的调节有关。

抗肺纤中药颗粒对染矽尘大鼠肺组织纤维化的干预作用

将64只SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组和中药干预组(500、1000 mg/kg),对照组大鼠灌注1.0 ml 0.9%生理盐水造模,模型组和中药干预组灌注等量的SiO_(2)悬浊液,其后模型组和对照组每天灌胃0.9%生理盐水,中药干预组每天分别灌胃500、1000 mg/kg抗肺纤中药颗粒。造模后第14天和第28天处死大鼠,进行肺组织病理学观察及肺部抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、抗转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2/3蛋白和小鼠来源抗Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)的水平检测。结果表明,中药干预可抑制SiO_(2)诱导大鼠的肺组织TNF-α、IL-1β和TGF-β1水平增高及Col-Ⅰ沉积,减缓大鼠肺泡炎症及矽肺纤维化进展,干预作用可能与TGF-β1/Smad通路有关。