Smad3 shRNA抑制TGFβ1对HSC-T6细胞活化的抗肝纤维化作用

目的观察Smad3 shRNA对TGFβ1作用于大鼠HSC-T6细胞增殖、细胞周期以及分泌肝纤维化胶原的影响。方法Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6,应用流式细胞仪检测其感染率,Real-time PCR检测对Smad3 mRNA表达的抑制作用;将HSC-T6对照、HSC-T6+TGFβ1(10 ng/ml)、Smad3 shRNA以及Smad3 shRNA+TGFβ1(10 ng/ml)这4组细胞进行如下检测:(1)MTT检测细胞增殖;(2)流式细胞仪检测TGFβ1作用24、36 h细胞周期分布;(3)Real-time PCR检测24、36 h时细胞周期、增殖及肝纤维化相关基因mRNA的表达变化;(4)ELISA检测24、36 h培养液上清中胶原蛋白(COL)Ⅰ、COLⅢ及α-SMA的含量。结果Smad3 shRNA慢病毒感染HSC-T6细胞至96 h,感染率为71.3%,对Smad3 mRNA的表达抑制率为50%。(1)MTT结果显示,TGFβ1促进HSC-T6增殖;与相应未感染Smad3 shRNA病毒组相比,Smad3 shRNA组以及Smad3 shRNA+TGFβ1组细胞增殖能力均下降。(2)细胞周期检测发现,24、36 h时,Smad3 shRNA+TGFβ1组与Smad3 shRNA组相比,细胞周期分布差异无统计学意义(P>0.05);(3)Real-time PCR显示,Smad3 shRNA+TGFβ1组较HSC-T6+TGFβ1组,Smad3、原癌基因(c-myc)、细胞周期依赖性激酶-2(CDK-2)、细胞周期素E(cyclin E)、表皮生长因子(EGF)、核因子-κB(NF-κB)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、COLⅠ及基质金属蛋白酶(MMP)14等基因的mRNA在24、36 h表达均下调,HGF mRNA及COLⅢmRNA在24 h时上调、36 h时下调,Bcl-2 mRNA、MMP1 mRNA及MMP9 mRNA在24 h和36 h两个时段均表达上调。(4)ELISA检测发现,同一时间点比较,分别在24、36 h,TGFβ1可促进HSC-T6细胞COLⅠ(P=0.00,P=0.02)、α-SMA(P=0.00,P=0.01)的分泌;与HSC-T6+TGFβ1组相比,Smad3 shRNA+TGFβ1组COLⅠ于36 h分泌减少(P=0.00)、而α-SMA在24、36 h两个时间点分泌减少(P=0.00)。结论 Smad3 shRNA抑制了TGFβ1对HSC-T6的活化,显示了抗肝纤维化作用。

shRNA重组慢病毒沉默SMAD3对大鼠肝纤维化的抑制作用

目的观察SMAD3 shRNA重组慢病毒对大鼠肝纤维化的影响。方法随机将Wistar大鼠60只分为生理盐水对照组(20只)、shRNA对照组(20只)和SMAD3 shRNA组(20只)。对shRNA对照组和SMAD3 shRNA组大鼠,通过脾脏注射法给予慢病毒1.0×108TU/只,生理盐水对照组则给予等体积500μl生理盐水,给药1w后开始制备大鼠四氯化碳肝纤维化模型。在造模4w和8w时,采用Real-Time PCR法检测肝组织SMAD3表达;采用ELISA法检测血清I型和III型胶原水平。结果在造模4w和8w时,与生理盐水对照组和shRNA对照组比,SMAD3 shRNA组肝组织SMAD3 mRNA水平显著降低(4w:P=0.000,P=0.001;8w:P=0.001,P=0.009);肝组织学检查显示,在造模4w和8w时,SMAD3 shRNA组大鼠肝纤维化程度减轻;在造模4w时,SMAD3 shRNA组动物血清I型胶原[(3.33±1.60)ng/ml]和III型胶原[(1.32±0.56)ng/ml]明显低于生理盐水对照组[(69.4±13.67)ng/ml,(3.90±1.41)ng/ml],也低于shRNA对照组[(66.8±3.50)ng/ml和(3.80±0.93)ng/ml,均P<0.01];在8w时,各组间胶原水平比较无明显差异(P>0.05)。结论 SMAD3 shRNA在大鼠体内能明显减轻肝纤维化程度。

靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒对大鼠肝再生的作用

目的:应用大鼠肝大部切除肝再生模型,将前期构建好的靶向SMAD3基因的shRNA重组慢病毒注射入大鼠体内,观察SMAD3 shRNA对大鼠肝再生的影响.方法:将60只♂Wistar大鼠随机分为3组:SMAD3 shRNA组(20只)、shRNA对照组(20只)、生理盐水对照组(20只),通过脾脏注射方法给药,慢病毒给药剂量为1.0×108TU/只,生理盐水对照组给予等体积500L生理盐水.给药96h后行2/3肝大部切除,构建大鼠肝再生模型;肝大部切除术后96h各组分别除死大鼠7只,剩余大鼠于144h处死,收集肝脏标本,Real-Time PCR、免疫组织化学检测肝组织SMAD3表达,免疫组织化学检测肝组织Ki67表达,测定大鼠肝质量/体质量,观察SMAD3 shRNA对肝再生的影响.结果:Real-Time PCR检测显示,通过脾脏注射慢病毒,在96、144h处死时间点,SMAD3 shRNA组SMAD3 mRNA分别较shRNA对照组平均下降73%、63%.免疫组织化学检测显示SMAD3蛋白表达明显下降.Ki67免疫组织化学结果显示,肝大部切除术后96、144h,SMAD3 shRNA组Ki67表达阳性细胞数均明显多于生理盐水对照组及shRNA对照组,表明抑制SMAD3表达后肝细胞增殖活跃.大鼠肝质量与体质量比值显示,SMAD3 shRNA组分别较生理盐水对照组及shRNA对照组有增加趋势(96h:4.50±0.43vs3.97±0.55vs3.98±0.40,144h:4.66±0.54vs4.15±0.51vs4.20±0.34),但没有统计学意义(P>0.05).结论:SMAD3 shRNA在大鼠体内可一定程度上促进肝细胞增殖,但对肝再生的促进作用尚弱.

特异性shRNA抑制小鼠L929成纤维细胞Smad3基因表达

目的设计特异性shRNA并检测其对小鼠L929成纤维细胞Smad3基因的抑制作用。方法根据小鼠Smad3 mRNA,编码3种不同序列shRNA。shRNA1起始位置为第495位核苷酸,GC含量为42.1%;shRNA2起始位置第562位核苷酸,GC含量为52.6%;shRNA3起始位置第1473位核苷酸,GC含量为52.6%。3种shRNA被合成进质粒pGenesil1.1。合成后的质粒pGenesil1.1Smad3-1,pGenesil1.1Smad3-2和pGenesil1.1Smad3-3分别转染体外培养的小鼠L929成纤维细胞,同时设立空白对照组和负对照组。48和72h后通过RealtimePCR和Westernblot检测其对Smad3基因表达的影响。结果 3种shRNA对Smad3基因在小鼠L929成纤维细胞表达在48和72h均有不同程度的抑制作用。其中,以shRNA2和shRNA3抑制效果最为明显。结论合成特异性的shRNA可以有效抑制Smad3基因在小鼠L929成纤维细胞的表达。

SARA低表达对Activin A/Smads环路活性的影响

目的探讨下调Smad锚捉蛋白(SARA)表达对Activin A/Smads环路活性的影响。方法利用RNA干扰技术,设计靶向大鼠SARA基因的短发卡RNA(shRNA),瞬时转染激活素A(ActA)高表达的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞。转染48h后倒置荧光显微镜观察转染效率,实时定量PCR、Western blot检测SARA基因的表达情况。对阳性转染组及阴性转染组细胞换液3h后,Western blot检测Smad3总蛋白及磷酸化蛋白的表达。结果靶向SARA基因的SARA-shRNA及对照NC-shRNA质粒的转染效率均超过70%。转染48h后,SARA基因转录及蛋白水平的表达显著降低。细胞换液3h后,与NC-shRNA组比较SARA-shRNA组Smad3总蛋白及磷酸化蛋白下调44%和57%。结论 SARA基因低表达下调ActA/Smads环路活性。