金雀异黄素通过调控TGF-β1/Smad3信号通路对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的影响

目的 探讨金雀异黄素减轻糖尿病大鼠心肌纤维化的作用及潜在机制。方法 通过高脂饮食结合腹腔注射链脲菌素(STZ)法建立大鼠2型糖尿病(T2DM)模型,并随机分为模型组、二甲双胍组(100 mg/kg)及金雀异黄素低、高剂量组(50、100 mg/kg),另设正常组给予常规饮食,每组10只。各给药组灌胃给药8周,检测体质量、心功能、心脏质量及心脏指数,血清CK-MB、AST及LDH活性,观察心肌纤维化程度,心肌组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad同源物3(Smad3)mRNA和蛋白表达,心肌组织Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)和Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)蛋白分布及表达。结果 与模型组比较,金雀异黄素各剂量组大鼠体质量、每搏输出量(SV)及射血分数(EF)升高(P<0.01),心脏指数、左心室收缩末期内径(LVIDs)、血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)活性降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织胶原相对面积及CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达均降低(P<0.05,P<0.01),心肌组织TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),金雀异黄素高剂量组左心室舒张末期内径(LVIDd)降低(P<0.05)。结论 金雀异黄素可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,减轻2型糖尿病大鼠心肌纤维化作用,进而发挥保护心脏效应。

加味补阳还五汤对术后腹腔粘连TGF-β1/Smad3通路和腹膜间皮细胞上皮-间充质转化的影响

目的探讨加味补阳还五汤对术后腹腔粘连转化生长因子β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)/Smad3通路和腹膜间皮细胞的上皮-间充质转化的影响。方法将108只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、透明质酸钠组、加味补阳还五汤组。模型组、透明质酸钠组及加味补阳还五汤组进行术后腹腔粘连模型造模,透明质酸钠为阳性对照组,在手术造模后,一次性腹腔喷洒1%的透明质酸钠凝胶,0.5mL/kg。加味补阳还五汤组术后第2天开始灌胃,灌胃剂量为19.5g/(kg·d)。分别于术后7、14、28d分批将动物处死,每次每组处死9只大鼠。在损伤部位取材:应用免疫组织化学法观察粘连部位的纤维化通路相关蛋白TGF-β1、Smad3、Smad7的表达情况;以及其下游胶原沉积相关蛋白Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ,Col-Ⅲ)的表达情况和上皮-间充质转化(Epithelialmesenchy-maltransition,EMT)相关的蛋白E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smoothmuscleactin,α-SMA)的表达情况。结果①不同组别间,术后7、14、28d3个时间节点,TGF-β1/Smad3纤维化通路相关蛋白表达情况:与正常组比较,模型组TGF-β1蛋白表达增多(均为P<0.01);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组TGF-β1蛋白表达减少(均为P<0.05)。与正常组比较,模型组Smad3蛋白表达增多(均为P<0.05);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组Smad3蛋白表达减少(P<0.05)。与正常组比较,模型组Smad7蛋白表达减少(均为P<0.01);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组Smad7蛋白表达增多(均为P<0.05)。②胶原沉积情况:术后7、14、28d3个时间节点,Col-Ⅰ蛋白表达存在差异:与正常组比较,模型组Col-Ⅰ蛋白表达增多(均P<0.01);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组Col-Ⅰ蛋白表达减少(均P<0.01)。与正常组比较,模型组Col-Ⅲ蛋白表达增多(均P<0.01);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组Col-Ⅲ蛋白表达减少(均P<0.01)。③EMT相关指标表达情况:不同组别间,术后7、14、28d3个时间节点,E-Cadherin蛋白表达存在差异:与正常组比较,模型组E-Cadherin蛋白表达减少(均P<0.05);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组E-Cadherin蛋白表达增多(均P<0.05)。与正常组比较,模型组α-SMA蛋白表达增多(均P<0.01);与模型组比较,透明质酸钠组和加味补阳还五汤组α-SMA蛋白表达减少(均P<0.05)。结论加味补阳还五汤防治术后腹腔的机制可能是通过抑制TGF-β1/Smad3通路相关蛋白TGF-β1、Smad3蛋白、促进Smad7蛋白的表达抑制纤维化;促进E-Cadherin蛋白、减少α-SMA蛋白表达,减轻腹膜间皮细胞的EMT,抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达减少细胞外基质的沉积,从而减轻腹膜粘连。

miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路对特发性矮小症的软骨细胞增殖、肥大的影响机制

目的研究miR-10b对特发性矮小症(ISS)的影响及作用机制。方法收集ISS患儿(ISS组)和体检健康儿童(健康对照组)各54例,qPCR检验血清miR-10b表达量,分析ISS组患儿血清miR-10b表达与患儿临床资料的关系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自阴性对照转染C28/I2细胞,利用CCK-8实验检测C28/I2细胞增殖能力,Western blot检测侏儒相关转录因子2(RUNX2)、X型胶原α1链(COL10A1)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、SMAD3、pSMAD3蛋白表达量。在StarBase数据库筛选miR-10b靶点,利用双萤光素酶报告基因实验验证miR-10b与TGFBR1的靶向关系。结果ISS组血清miR-10b表达量高于健康对照组,且miR-10b表达越高,患儿的身高、IGF-1、骨特异性碱性磷酸酶的下降越明显(P<0.05)。与NC组相比,miR-10b inhibitor组细胞增殖能力升高,RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表达上调(P<0.05);StarBase数据库提示miR-10b存在TGFBR1的结合位点,双萤光素酶报告基因实验证实两者结合。与si-NC相比,si-TGFBR1组TGFBR1表达量下调,细胞增殖能力下降(P<0.05)。结论miR-10b通过靶向TGFBR1/SMAD3通路在特发性矮小症中抑制软骨细胞的增殖、肥大。

白当归素通过调节TGF-β1/Smad3通路改善特发性肺纤维化的作用机制研究

为了研究白当归素(byakangelicin,BYAK)对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的成纤维细胞激活和博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),并初步探讨其作用机制.在细胞实验中,通过TGF-β1诱导肺成纤维细胞激活模型;在动物实验中,通过苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H&E)和羟脯氨酸含量检测评价肺纤维化程度;免疫印迹技术(western blot,WB)检测肺纤维化相关蛋白α-SMA(alpha-smooth muscle actin)、细胞外基质生成蛋白CoL1A1(collagen type I)、Smad3、p-Smad3的表达.结果表明:与正常组相比,TGF-β1组α-SMA蛋白升高,CoL1A1显著发生上调,博来霉素诱导的小鼠肺组织结构遭到破坏;与模型组相比,白当归素可以剂量依赖地抑制TGF-β1诱导的α-SMA和CoL1A1的蛋白表达,同时显著改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程;进一步研究发现,白当归素通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,明显改善了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化进程.白当归素可能是通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路抑制成纤维细胞活化和减少细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的生成,从而对特发性肺纤维化的预防和治疗具有潜在作用.

β2肾上腺素受体通过TGF-β1/Smad3信号通路调控创面愈合中的纤维增生

目的探讨β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,ADRB2)在创面愈合过程中对纤维增生的调控机制。方法将12只小鼠背部皮肤随机注射非特异性敲减ADRB2基因的腺相关病毒(AAV-ADRB2组,n=6)和对照病毒(AAV-NC组,n=6)21 d后,在背部建立全层皮肤缺损创面愈合模型。记录术后第1、3、5、7天创面愈合率;采用H-E染色、Masson染色和免疫组化染色观察创面组织结构、纤维化程度及α-平滑肌肌动蛋白表达;定量PCR检测ADRB2、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA水平;Western印迹法检测胶原纤维1A1、胶原纤维3A1、TGF-β1、Smad3蛋白表达水平。结果术后第5、7天,AAV-ADRB2组创面愈合率显著下降(P<0.05),伴随表皮增厚、炎症细胞增多、纤维细胞减少、胶原沉积降低;α-SMA水平显著下降(P<0.05);COL1A1/COL3A1比例减少(P<0.05);ADRB2 mRNA水平显著降低(P<0.01),MMP-1和MMP-8 mRNA水平升高(P<0.01);TGF-β1/Smad3蛋白水平显著下降(P<0.05)。结论ADRB2敲减通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路,减少创面纤维化反应和结缔组织含量,提高MMP mRNA水平,降低Ⅰ型/Ⅲ型胶原比例。

基于Smad3抑制剂SIS3对兔宫颈粘连程度影响的机制研究

目的:研究信号传导蛋白(Smad3)抑制剂SIS3对宫腔粘连模型兔血清中转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3表达的影响,为宫腔粘连治疗效果提供理论依据。方法:将18只成年雌性新西兰大白兔随机分为正常组、模型组、SIS3干预组,每组6只。除正常组外,模型组和干预组采用刮宫法建立宫腔粘连模型。造模后干预组每天给予2.5μg/g SIS3注射处理,正常组(开腹未刮宫)和模型组每天给予等体积0.9%氯化钠溶液注射。注射持续14 d后取各组实验兔血清。采用ELISA酶联免疫法检测各组实验兔血清中TGF-β1、Smad3的蛋白表达量。采用实时荧光定量(RT-qPCR)法检测各组实验兔血清中TGF-β1、Smad3的mRNA表达量。结果:与正常组相比,模型组实验兔血清中TGF-β1和Smad3的蛋白及mRNA表达均显著升高(P<0.05);与模型组相比,SIS3干预组实验兔血清中TGF-β1和Smad3的蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.05)。此外,TGF-β1蛋白和Smad3蛋白在血清中的表达水平呈显著正相关(R2=0.52),TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA在血清中的表达水平亦呈显著正相关(R2=0.84)。结论:SIS3能抑制宫腔粘连模型兔血清中TGF-β1、Smad3的表达,具有潜在治疗宫腔粘连的作用。

3-吲哚丙酸抑制腹膜间皮细胞EMT和纤维化的机制研究

目的 评估3-吲哚丙酸(3-indoleacetic acid, IPA)对脂多糖(lipolyaccharide, LPS)诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和纤维化的影响。方法 CCK-8法检测不同浓度(0.1、1.0和10μmol/L)的IPA对LPS处理前后的小鼠腹膜间皮细胞增殖活性的影响,确定IPA最佳使用剂量。将小鼠腹膜间皮细胞分成Control组、LPS组、LPS+IPA组、LPS+LY364947(TGF-β1/Smad3通路抑制剂)组、LPS+IPA+LY364947组和LPS+IPA+SRI-011381(TGF-β1/Smad3通路激活剂)组;CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell法检测细胞侵袭,ELISA检测培养上清中间质表型α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的浓度,Western blot检测细胞中α-SMA,EMT相关因子E-cadherin, TGF-β1/Smad3通路相关因子Smad3、p-Smad3的蛋白表达。结果 IPA的最佳使用剂量为1.0μmol/L。与Control组相比,LPS组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平下降(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达水平和p-Smad3/Smad3升高(均P<0.01)。与LPS组相比,LPS+IPA组和LPS+LY364947组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平上升(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达和p-Smad3/Smad3下降(均P<0.01)。与LPS+IPA组相比,LPS+IPA+LY364947组所测指标趋势更加显著,LPS+IPA+SRI-011381组所测指标变化趋势均被逆转。结论 IPA通过抑制TGF-β1/Smad3通路中Smad3蛋白的磷酸化,从而抑制细胞EMT进展,减轻LPS诱导的腹膜间皮细胞损伤。

紫白膏对大鼠肛周创面愈合及TGF-β1、Smad3表达的影响

目的 研究紫白膏对大鼠肛周创面愈合及转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3表达的影响。方法将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、对照组和紫白膏组,每组10只。除空白组外,其余3组行大鼠肛周创面造模。模型组不予特殊治疗,紫白膏组、对照组分别予紫白膏和凡士林外敷干预,均连续干预14 d。观察4组大鼠治疗14 d后的创面愈合率;采用Western blot和qPCR检测大鼠创面组织中TGF-β1、Smad3蛋白及mRNA表达情况。结果 与空白组比较,模型组大鼠肛周创面愈合率明显降低(P<0.05),创面组织TGF-β1、Smad3蛋白表达量和mRNA相对表达水平均明显提高(P均<0.05);与模型组比较,紫白膏组和对照组大鼠肛周创面愈合率均明显提高(P均<0.05),创面组织TGF-β1、Smad3蛋白表达量和mRNA相对表达水平均明显降低(P均<0.05);与对照组比较,紫白膏组大鼠肛周创面愈合率均明显提高(P<0.05),创面组织TGF-β1、Smad3蛋白表达量和mRNA相对表达水平均明显降低(P均<0.05)。结论 紫白膏可能通过调控大鼠创面组织TGF-β1、Smad3的表达来促进肛周创面愈合。

miR-590-5p靶向TGF-β1/Smad3通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的研究

目的探讨miR-590-5p通过TGF-β1/Smad3通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的作用。方法获取瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养采用随机数字表法分组,分为空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组、miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组,其中空白对照组不进行转染,空载体转染组转染空载体、miR-590-5p mimic组转染miR-590-5p mimic、miR-590-5p inhibitor组转染miR-590-5p inhibitor、miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组转染miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1。采用CCK-8试验检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell试验检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测TGF-β1、Smad3蛋白表达。结果miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞培养24、48和72 h时细胞增殖活力明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞凋亡率明显高于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞侵袭数明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞TGF-β1、Smad3蛋白相对表达量明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抑制miR-590-5p表达,可促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭以及抑制细胞凋亡,可能与通过TGF-β1/Smad3通路调控有关。

百令胶囊上调miR-145-5p逆转TGF-β_(1)/Smad3通路机制初探

目的探讨百令胶囊(BLC)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺损伤的改善作用,以及对香烟烟雾提取物(CSE)作用下人支气管上皮细胞BEAS-2B生长的影响。方法将60只SD大鼠随机分为正常对照组(A组,灌胃生理盐水2 mL),模型组(B组,灌胃生理盐水2 mL),BLC组(C组,灌胃BLC 5.5 mg/kg),miR-145-5p inhibitorNC组(D组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitorNC 6μL),miR-145-5p inhibitor组(E组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitor 6μL),各12只。以香烟烟雾吸入法复制大鼠COPD模型。建模成功后灌胃相应药物或生理盐水(每日1次),尾静脉注射相应药物(每周1次),连续8周。以0(空白对照),3%,5%,10%,20%CSE,以及加5%,10%,20%,40%的BLC药物血清(BLC-S)孵育细胞48 h。检测大鼠潮气量(TV)、呼气峰流量(PEF)、分钟通气量(MV)、用力肺活量(FVC)和第0.3秒用力呼气容积(FEV_(0.3));观察肺组织病理形态;免疫组化法检测Smad3表达水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定转化生长因子(TGF)-β_(1)表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miR-145-5p mRNA表达水平。采用CCK-8法检测细胞活力。结果与B组比较,C组及D组大鼠TV,PEF,MV,FVC,FEV0.3均显著升高;与D组比较,E组大鼠上述指标均显著降低(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织病理形态显著改善,平均肺泡数显著增加,肺泡直径显著减小;与D组比较,E组大鼠肺组织病理形态未改善,且平均肺泡数显著减少,肺泡直径显著增长(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下的细胞活力显著增强(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与D组比较,E组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著升高,miR-145-5p mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下细胞Smad3和TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与5%CSE+20%BLC-S+inhibitor NC条件比较,同水平inhibitor条件下细胞Smad3及TGF-β_(1)表达水平均显著升高(P<0.05)。结论BLC在体内和体外均显示出对香烟诱导COPD的保护作用,其机制可能与上调miR-145-5p水平逆转香烟暴露激活的TGF-β_(1)/Smad3信号通路有关。

养阴祛瘀方对高尿酸性肾病大鼠保护作用及对肾脏TGF-β_(1)/Smad3信号通路的影响

目的观察养阴祛瘀方对高尿酸性肾病大鼠肾保护作用及对炎症因子和转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad3通路的影响,探讨其作用机制。方法取56只雄性SD大鼠,随机选取13只作为空白组,其余大鼠采用氧嗪酸钾联合腺嘌呤灌胃法建立高尿酸性肾病模型。将造模成功的40只大鼠随机分为模型组及养阴祛瘀高、中、低剂量组,每组10只。养阴祛瘀高、中、低剂量组分别给予养阴祛瘀方37.2 g/(kg·d)、18.6 g/(kg·d)、9.3 g/(kg·d)灌胃,空白组及模型组给予等量生理盐水灌胃,均每天1次,连续灌胃3周。收集尿液检测24 h尿蛋白定量;取下腔静脉血,检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;留取肾组织,HE染色观察肾组织病理形态,荧光显微镜下计算阳性细胞百分比;RT-PCR法检测肾组织中TGF-β_(1)、Smad3 mRNA相对表达量。结果模型组24 h尿蛋白定量及SCr、BUN、UA、IL-6、TNF-α水平均明显高于空白组(P均<0.05);肾小管萎缩,管内见尿酸盐晶体沉积,间质中可见较多炎性细胞浸润;肾组织中阳性细胞百分比及TGF-β_(1)、Smad3 mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)。养阴祛瘀各组24 h尿蛋白定量及血清IL-6、TNF-α水平和养阴祛瘀高、中剂量组SCr、BUN、UA水平均明显低于模型组(P均<0.05),且养阴祛瘀高剂量组血清UA、IL-6、TNF-α水平均明显低于养阴祛瘀中、低剂量组(P均<0.05);养阴祛瘀中、高剂量组尿酸盐沉积、炎性细胞浸润、肾小管损伤较前减轻,而养阴祛瘀低剂量组改善不明显;养阴祛瘀各组肾组织中阳性细胞百分比及TGF-β_(1)、Smad3 mRNA相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),且养阴祛瘀高剂量组各指标均明显低于养阴祛瘀低剂量组(P均<0.05)。结论养阴祛瘀方可保护高尿酸性肾病大鼠肾脏,减少蛋白尿,机制与下调炎症因子IL-6、TNF-α表达,抑制肾组织中TGF-β_(1)/Smad3通路激活有关。

AACO方调控TGF-β1/Smad3信号通路保护慢性心力衰竭小鼠心肌纤维化的作用机制研究

目的基于TGF-β1/Smad3信号通路探讨AACO方防治慢性心力衰竭(CHF)心肌纤维化的可能作用机制。方法将40只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、AACO方组和卡维地洛组,每组10只。采用主动脉弓缩窄术建立CHF小鼠模型,分别予相应药物灌胃,假手术组和模型组予等量双蒸水灌胃,连续8周。超声心动图检测小鼠心脏功能;HE染色观察心脏病理变化;Masson染色和苦味酸天狼猩红染色检测心脏组织胶原容积分数(CVF)和纤维化程度;免疫荧光染色检测心脏组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达;RT-qPCR检测心尖组织ColⅠ、ColⅢmRNA表达;Western blot检测心尖组织α-SMA、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad3、p-Smad3蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)显著减少,左室舒张末期内径(LVIDd)显著增加(P<0.01),心肌细胞排列紊乱,心肌间质疏松,心脏组织CVF、纤维化面积比显著增加(P<0.01),心尖组织ColⅠ、ColⅢmRNA及TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、ColⅠ蛋白表达均显著升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,AACO方组小鼠LVEF、FS显著增加,LVIDd显著减少(P<0.01),心肌细胞排列较为规则,心脏组织CVF、纤维化面积比显著减少(P<0.05,P<0.01),心尖组织ColⅠ、ColⅢmRNA及TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、ColⅠ蛋白表达均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论AACO方可显著抑制CHF模型小鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。

脆弱拟杆菌ATCC25285通过TGF-β/Smad3通路诱导Treg细胞分化缓解结肠炎

肠道菌群的变化通常与不同的胃肠道疾病有关,维持肠道菌群稳态可以增强免疫耐受性,调节肠道免疫平衡。已有研究发现,增加肠道菌群拟杆菌门中脆弱拟杆菌(B.fragilis)的相对丰度,可以显著增强肠道调节性T细胞(Treg)和抗炎细胞因子的表达,缓解肠道炎症。然而,B.fragilis调节肠道免疫的具体机制尚不清楚。本研究通过给SPF级C57BL/6小鼠饮用3%DSS溶液构建急性结肠炎模型,自由饮用7 d后,通过灌胃对已患结肠炎小鼠外源性补充B.fragilis,研究B.fragilis对肠道免疫的调控作用及其作用机制。实验结果表明,B.fragilis可以改善结肠炎小鼠的肠道菌群紊乱,增加肠道菌群主要代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)的含量。通过提取小鼠组织淋巴细胞、初始CD4+T细胞、使用脂质体修饰的siRNA敲低小鼠Smad3,采用流式细胞术进一步研究发现B.fragilis能够通过TGF-β/Smad3信号通路诱导肠道Treg细胞及相关细胞因子的表达,增强肠道调节免疫,进而缓解结肠炎。此外,本研究还发现B.fragilis通过增加肠道中活性氧(ROS)的表达来激活TGF-β,从而诱导Treg细胞分化并发挥免疫调节作用。

HAX-1通过调控MDM2/SMAD3通路对TGF-β1诱导的特发性肺间质纤维化的作用机制

目的探讨造血细胞特异性蛋白1相关蛋白X-1(HAX-1)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的特发性肺间质纤维化的作用及机制。方法将A549细胞分为对照组(无处理)、TGF-β1组(用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、NC si组(用阴性对照siRNA转染细胞,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、HAX-1 si组(用HAX-1 siRNA转染细胞,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、HAX-1 si+pcDNA3.1组(用HAX-1 siRNA转染细胞,再用pcDNA3.1空质粒转染细胞,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、HAX-1 si+MDM2组(用HAX-1 siRNA转染细胞,再用MDM2过表达质粒pcDNA3.1-MDM2转染细胞,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、HAX-1 si+MDM2+DMSO组(用HAX-1 siRNA转染细胞,再用MDM2过表达质粒pcDNA3.1-MDM2转染细胞,向细胞培养液中加入溶剂DMSO处理细胞30 min,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)、HAX-1 si+MDM2+SIS3组(用HAX-1 siRNA转染细胞,再用MDM2过表达质粒pcDNA3.1-MDM2转染细胞,用终浓度为1μmol·L^(-1)溶于DMSO的SIS3处理细胞30 min,再用5μg·L^(-1)的TGF-β1诱导48 h)。相应处理结束后,采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化;Western blot检测HAX-1、鼠双微体基因2(MDM2)、SMAD3、p-SMAD3、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)蛋白表达水平。结果TGF-β1诱导细胞后,细胞由鹅卵石形或多角形转变为梭形、纺锤形,E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05),HAX-1、α-SMA和COL1A1蛋白表达升高(P<0.05)。干扰HAX-1可提高E-cadherin蛋白表达(P<0.05),抑制MDM2、p-SMAD3、α-SMA和COL1A1蛋白表达(P<0.05),并且细胞形态又转变为鹅卵石形或多角形。MDM2过表达抵消HAX-1干扰对p-SMAD3、E-cadherin、α-SMA和COL1A1蛋白表达的影响(P<0.05)。SMAD3抑制剂SIS3处理后细胞形态又转变为鹅卵石形或多角形,E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),α-SMA和COL1A1蛋白表达下降(P<0.05)。结论HAX-1在TGF-β1诱导的A549细胞中高表达,HAX-1敲低可通过MDM2/SMAD3通路抑制TGF-β1诱导的肺泡细胞纤维化过程。

1,25-(OH)_(2)-VitD3通过抑制Snail1-SMAD3/SMAD4复合物形成减轻糖尿病肾病肾小管间质纤维化

目的研究1,25-(OH)2-VitD3(VitD3)对糖尿病肾病肾小管间质纤维化的影响.方法NRK-52E肾小管上皮细胞分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖培养基处理)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖的培养基处理)和高糖加VitD3组(25 mmol/L葡萄糖培养基联合10-8 mol/L VitD3).实时定量PCR和Western blot法分别检测NRK-52E细胞Snail家族转录抑制物1(Snail1)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD4、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的mRNA和蛋白表达;免疫荧光细胞化学染色检测Snail1、SMAD3、SMAD4的表达及定位;通过染色质免疫沉淀检测Snail1与SMAD3/SMAD4形成的复合物与柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)的启动子结合情况;荧光素酶报告检测Snail1、SMAD3/SMAD4和E-cadherin的相互作用;采用小干扰RNA(siRNA)抑制细胞Snail1、SMAD4的表达后,通过实时定量PCR检测E-cadherin的mRNA表达.SD大鼠随机分为对照组、DKD组和VitD3处理组.DKD组和VitD3处理组通过注射链脲佐菌素(STZ)先制备DKD模型,DKD造模成功后,VitD3处理组予60ng/kgVitD3灌胃,对照组和DKD组给予生理盐水灌胃;DKD组和VitD3处理组同时皮下注射胰岛素(1~2)U/kg控制血糖,持续8周.采用实时定量PCR和Western blot法分别检测肾组织中Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA、E-cadherin的mRNA和蛋白水平,免疫组织化学检测肾组织Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA和E-cadherin的表达及定位.结果与对照组相比,高糖处理的NRK-52E细胞及DKD肾组织Snail1、SMAD3、SMAD4和α-SMA的mRNA和蛋白表达均上调,E-cadherin表达下调;给予VitD3干预后,DKD模型中Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA和E-cadherin的表达水平恢复到与对照组接近.染色质免疫沉淀提示Snail1、SMAD3/SMAD4与CAR的启动子Ⅳ结合,而VitD3能够阻止Snail1、SMAD3/SMAD4与CAR的启动子Ⅳ结合;荧光素酶报告检测证实Snail1、SMAD3/SMAD4和E-cadherin的互作关系;用siRNA抑制Snail1、SMAD4的mRNA后,上调高糖诱导下E-cadherin的表达.结论VitD3可抑制Snail1-SMAD3/SMAD4的复合物的形成,减轻糖尿病肾病肾小管间质纤维化.

益气养阴活血方对肺纤维化大鼠TGF-β1、Smad3、MMP9及TIMP1表达的影响

目的观察益气养阴活血方对肺纤维化大鼠的影响,探讨其改善肺纤维化的作用机制。方法采用博来霉素气管滴注制备肺纤维化大鼠模型,将大鼠随机分为模型组、醋酸泼尼松组和益气养阴活血方高、中、低剂量组(中药高、中、低剂量组),每组8只,另取8只正常大鼠作为空白组,给药组予相应药物灌胃28 d,空白组和模型组予等体积生理盐水灌胃。末次给药后,行肺功能检测,HE和Masson染色观察肺组织病理改变,免疫组化染色检测肺组织纤连蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)表达,RT-PCR检测肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad3、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)mRNA表达,Western blot检测肺组织TGF-β1、Smad3、p-Smad3、MMP9和TIMP1蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠吸气时间和呼气时间显著缩短,每分钟通气量和呼吸频率显著增加(P<0.01),肺组织结构损伤明显,肺泡塌陷、萎缩、间隔变宽,有大量胶原纤维沉积,肺组织FN和LN表达显著升高(P<0.01),TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA和TGF-β1、p-Smad3、MMP9蛋白表达显著升高,TIMP1 mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,中药高剂量组大鼠吸气时间和呼气时间显著延长,每分钟通气量和呼吸频率显著减少(P<0.01),肺泡形态较完整、间隔变窄,炎性细胞浸润减少,胶原纤维沉积减少,肺组织FN和LN表达显著降低(P<0.05,P<0.01),TGF-β1、Smad3、MMP9 mRNA和TGF-β1、p-Smad3、MMP9蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05),TIMP1 mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论益气养阴活血方可能通过调控TGF-β1、Smad3、p-Smad3表达,调节MMP-9/TIMP-1平衡,降解细胞外基质,延缓肺纤维化发展。

圣草酚通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路改善糖尿病肾病大鼠肾纤维化

目的:探讨圣草酚对糖尿病肾病(DN)肾纤维化的影响及其作用机制。方法:采用多次小剂量注射链脲佐菌素建立DN大鼠模型,将建模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药物组(二甲双胍,0.5 g/kg)及圣草酚低、中、高剂量组(5、10、20 mg/kg),另设置对照组,每组12只。各给药组给予相应药物灌胃干预,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续12周。收集24 h尿液,检测24 h尿蛋白含量;腹主动脉取血,测定空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)含量;HE染色观察肾脏组织病理学变化;Masson染色观察肾脏组织纤维化程度;qRT-PCR检测肾组织中TGF-β1、CollagenⅠ和CollagenⅢmRNA表达水平;Western blot检测肾脏组织中TGF-β1、p-Smad3、Smad3、α-SMA蛋白表达水平。结果:与对照组相比,模型组大鼠肾脏出现明显损伤及纤维化,FBG、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量均显著升高(P<0.05),肾脏组织中TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ等mRNA表达水平及TGF-β1、p-Smad3和α-SMA等蛋白表达水平均显著提高(P<0.05);与模型组相比,圣草酚中、高剂量组和阳性药物组大鼠肾损伤明显改善,肾纤维化程度明显降低,FBG、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量均显著降低(P<0.05),肾脏组织中TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢmRNA表达水平及TGF-β1、p-Smad3和α-SMA蛋白表达水平均显著降低(P<0.05),而圣草酚低剂量组大鼠以上各指标变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:圣草酚可显著改善DN大鼠肾纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。

阳和解凝膏联合梅花针对局限性硬皮病小鼠TGF-β_(1)/Smad3信号通路的影响

目的:观察阳和解凝膏联合梅花针对局限性硬皮病小鼠模型转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))/Smad同源物3(Smad3)信号通路的影响。方法:将36只雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肝素钠组、阳和解凝膏组、梅花针组、阳和解凝膏联合梅花针组(联合治疗组),每组6只。除空白对照组外,其余各组小鼠均皮下注射博莱霉素建立局限性硬皮病小鼠模型。治疗4周后,处死小鼠取皮肤组织,采用Rodnan评分观察皮肤受累程度,HE染色观察皮肤组织病理学变化,偏振光皮肤镜观察皮肤组织表面血管和毛发的变化情况,免疫组织化学染色检测皮肤组织中TGF-β_(1)、白细胞介素-4(IL-4)、Smad3、Smad7的表达;Masson特殊染色检测皮肤胶原纤维的面积。结果:阳和解凝膏组、梅花针组、联合治疗组小鼠治疗后皮肤组织表面血管和毛发恢复生长;HE染色观察真皮变薄;Masson特殊染色胶原纤维面积减少;TGF-β_(1)、IL-4、Smad3表达降低,Smad7表达升高,且以联合治疗组效果最佳,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:阳和解凝膏、梅花针可以通过抑制TGF-β_(1)/Smad3信号通路的表达干预局限性硬皮病小鼠皮肤组织纤维化。阳和解凝膏联合梅花针治疗局限性硬皮病小鼠可以起到协同增效的作用。

丹参多酚酸盐抑制Wnt/β-catenin和TGF-β_(1)/Smad3信号通路激活抗纤维化及肾脏保护机制研究

目的:本研究探讨丹参多酚酸盐对慢性肾脏病(CKD)肾脏保护作用,并探讨其对肾脏纤维化的作用及分子机制。方法:将SPF级SD大鼠随机分为四组,每组6只,随机分为:(1)假手术组(Sham);(2)5/6肾切除组(CKD);(3)5/6肾切除+丹参多酚酸盐组100 mg/kg(CKD+Salvianolate);(4)5/6肾切除+吡非尼酮组(250 mg/kg)(CKD+Pirfenidone)。建立5/6肾脏切除的CKD大鼠模型,分别给予丹参多酚酸盐以及吡非尼酮进行干预,检查肾脏功能、肾脏损伤和纤维化指标。免疫组化和western-blot检测大鼠肾脏中Wnt/β-catenin和TGF-β_(1)/Smad3以及α-SMA和E-cadherin的表达水平。结果:丹参多酚酸盐改善CKD肾功能,降低血清肌酐(Scr),血尿素氮(BUN)水平。组织病理显示丹参多酚酸盐减轻肾小管损伤和细胞外基质(ECM)成分的沉积。丹参多酚酸盐能显著抑制上皮-间质转化(EMT)的标志蛋白α-SMA的表达,促使E-cadherin恢复。Wnt/β-catenin和TGF-β_(1)/Smad3在慢性肾脏病大鼠模型明显活化,丹参多酚酸盐治疗能明显抑制Wnt/β-catenin和TGF-β_(1)/Smad3的表达。结论:丹参多酚酸盐治疗可以改善肾脏功能,抑制肾脏纤维化发挥肾脏保护作用与Wnt/β-catenin和TGF-β_(1)/Smad3信号通路激活抑制有关,是肾脏纤维化的一种新型治疗策略。

TGF-β1/Smad3信号通路在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征大鼠认知障碍中的作用

目的:探讨TGF-β1/Smad3信号通路在阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)所致认知功障碍中的作用及TGF-β1的调控作用。方法:应用慢性间歇性缺氧方式(CIH)建造OSAS模型,TGF-β1抑制剂选择Disitertid(别名P144)。成年雄性SD大鼠42只随机分为7组:正常对照组(N组)、CIH 1W组、CIH 2W组、CIH 3W组、CIH 4W组、CIH 4W+P144组、CIH 4W+DMSO组,每组6只;分别给予不同的缺氧时间,其中CIH 4W+P144组和CIH 4W+DMSO组于造模前分别腹腔内注射P144(70μg/kg)和二甲亚砜(1 ml/kg),隔日1次。造模后,采用水迷宫实验检测大鼠学习及记忆能力,尼氏染色法观察各组大鼠海马CA1及CA3区的病理学改变,免疫印迹法对各组大鼠海马组织中TGF-β1、tSmad3、pSmad3蛋白定量检测。结果:OSAS模型大鼠出现白天嗜睡、烦躁等表现,缺氧期间相比复氧相间平均血氧饱和度下降>4%(P<0.05),造模成功。水迷宫实验中,与N组相比,CIH 2W、3W、4W时间点组大鼠逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少(均P<0.05);与CIH 4W+DMSO组相比,CIH 4W+P144组大鼠逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加(均P<0.05)。尼氏染色光镜观察结果显示,OSAS模型大鼠部分神经细胞结构破坏、尼氏小体数量减少溶解、胞浆着色浅、最终尼氏小体消失;CIH 4W+P144组尼氏小体数量多,且结构较完整,细胞受损程度相对轻。与N组比较,TGF-β1、pSmad3在CIH 1W、2W、3W、4W时间点的蛋白表达量递增(均P<0.05);与CIH 4W+DMSO组比较,CIH 4W+P144组TGF-β1、pSmad3蛋白表达量表达下降(均P<0.05)。结论:OSAS大鼠存在认知功能障碍,TGF-β1/Smad3信号通路被激活,特异性抑制TGF-β1后OSAS认知障碍大鼠的空间学习能力及记忆能力一定程度上得到改善。