磷酸化Smad3对糖尿病大鼠肾组织SnoN表达的影响

目的探讨磷酸化Smad3(p-Smad3)在糖尿病(DM)大鼠肾组织SnoN蛋白表达的影响。方法链脲佐菌素诱发大鼠DM模型,分为DM2、4、8、12、16和24 w组(n=6),每组均设鼠龄匹配的正常对照组(n=6)。生化方法测血糖和24 h尿蛋白;PAS染色观察肾组织病理学改变;免疫组化检测肾组织SnoN、Smad2/3和E3泛素连接酶APC10蛋白的表达;Western印迹方法动态观察肾皮质SnoN、p-Smad3、转化生长因子-β1(TGF-β1)和Smad2/3蛋白的表达;RT-PCR检测SnoN mRNA。结果 DM各组大鼠血糖和24 h尿蛋白较正常对照组均显著升高;SnoN和Smad2/3阳性染色主要见于肾小管上皮细胞,DM2 w起Smad2/3和p-Smad3蛋白表达多于正常对照组,DM4 w起SnoN蛋白少于正常对照组;各DM组肾组织TGF-β1、Smad2/3和APC10蛋白表达均多于正常对照组;DM各组SnoN mRNA与正常组相比差异无统计学意义。结论糖尿病肾病发病过程中p-Smad3可能与APC一起介导了SnoN蛋白的泛素化降解过程。

磷酸化Smad3在神经元样细胞氧糖剥夺中的表达变化

目的探讨磷酸化Smad3蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺中的表达变化。方法利用鼠神经生长因子(NGF)诱导大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)向神经元样细胞转化,应用无糖DMEM培养液联合连二亚硫酸钠(Na2S2O4)构建氧糖剥夺模型(oxygen-glucose deprivation,OGD),体外模拟神经元缺血性损伤。MTT检测神经元样细胞OGD 0,3,6和12h存活率,Western blot检测OGD前后磷酸化Smad3蛋白表达。结果成功建立神经元样PC12细胞的OGD模型;OGD 3h后细胞存活率显著下降,至OGD 12h降至最低54.7%;细胞内磷酸化Smad3表达在OGD 3、6h与OGD 0h组相比略升高,至OGD 12h时明显降低。结论磷酸化Smad3参与在神经元样细胞OGD早期ActA/Smads通路的活化。

3-吲哚丙酸抑制腹膜间皮细胞EMT和纤维化的机制研究

目的 评估3-吲哚丙酸(3-indoleacetic acid, IPA)对脂多糖(lipolyaccharide, LPS)诱导的小鼠腹膜间皮细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和纤维化的影响。方法 CCK-8法检测不同浓度(0.1、1.0和10μmol/L)的IPA对LPS处理前后的小鼠腹膜间皮细胞增殖活性的影响,确定IPA最佳使用剂量。将小鼠腹膜间皮细胞分成Control组、LPS组、LPS+IPA组、LPS+LY364947(TGF-β1/Smad3通路抑制剂)组、LPS+IPA+LY364947组和LPS+IPA+SRI-011381(TGF-β1/Smad3通路激活剂)组;CCK-8法检测细胞增殖活力,Transwell法检测细胞侵袭,ELISA检测培养上清中间质表型α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)的浓度,Western blot检测细胞中α-SMA,EMT相关因子E-cadherin, TGF-β1/Smad3通路相关因子Smad3、p-Smad3的蛋白表达。结果 IPA的最佳使用剂量为1.0μmol/L。与Control组相比,LPS组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平下降(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达水平和p-Smad3/Smad3升高(均P<0.01)。与LPS组相比,LPS+IPA组和LPS+LY364947组细胞增殖活力、E-cadherin表达水平上升(均P<0.01),侵袭能力、α-SMA表达和p-Smad3/Smad3下降(均P<0.01)。与LPS+IPA组相比,LPS+IPA+LY364947组所测指标趋势更加显著,LPS+IPA+SRI-011381组所测指标变化趋势均被逆转。结论 IPA通过抑制TGF-β1/Smad3通路中Smad3蛋白的磷酸化,从而抑制细胞EMT进展,减轻LPS诱导的腹膜间皮细胞损伤。

MEBT/MEBO对大鼠糖尿病足创面组织TGF-β1、Smad3、P-smad3表达及形态学结构的影响

目的:观察皮肤原位再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)对大鼠糖尿病足创面组织转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、Smad3、磷酸化smad3(P-smad3)表达及形态学结构的影响。方法:将80只健康雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、贝复济组和MEBT/MEBO组,每组各20只。模型组、MEBT/MEBO组和贝复济组大鼠参照糖尿病模型制备法,采用腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素,建立糖尿病动物模型;空白对照组大鼠则腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。分别于干预治疗后第5、14天各取相同部位创面组织,采用Western blot法检测TGF-β1、Smad3和P-smad3蛋白表达水平,常规病理技术观察溃疡创面组织形态学结构,各组间差异比较采用方差分析和秩和检验。结果:治疗后5 d,各组大鼠Smad3蛋白表达水平比较,差异均无统计学意义(F=1.036,P=0.388);MEBT/MEBO组、贝复济组的大鼠TGF-β1和P-smad3蛋白表达水平则均明显低于空白对照组(P=0.005、P=0.026,P=0.001、P=0.005);而且,上述2组大鼠的TGF-β1和P-smad3蛋白表达水平亦明显高于模型组(P=0.000);此外,与第5天结果相比,第14天MEBT/MEBO组与贝复济组的TGF-β1、P-smad3表达水平明显下降,差异均具有统计学意义(P=0.000)。治疗后第5天,MEBT/MEBO组、贝复济组及空白对照组溃疡创面肉芽组织中成纤维细胞形态、毛细血管新生情况优于模型组,但空白对照组成纤维细胞排列紊乱;第14天,MEBO组、贝复济组创面组织成纤维细胞及胶原纤维排列致密成形,空白对照组胶原纤维增生明显但排列紊乱,模型组胶原纤维呈团状增生。结论:MEBT/MEBO在创面愈合早期可激活TGF-β1/Smad3信号通路,促进创面损伤修复,而在愈合晚期则抑制该信号通路的活化,控制创面组织过度增生。

TGF-β1/Smads通路在体外培养的鼻息肉组织重构中的作用

目的·在体外培养的原代鼻息肉组织中检测探讨TGF-β1/Samds信号通路在鼻息肉组织重构中的作用。方法·筛选慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)和慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(CRSsNP)各15例,对照组为单纯鼻中隔偏曲患者10例。在术中收集鼻黏膜或鼻息肉组织,通过免疫组织化学染色(SP法)检测组织中蛋白表达水平及分布;通过马松(Masson)染色法检测胶原表达差异;通过实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测mRNA表达水平,Western blotting检测蛋白质表达水平。体外培养15例鼻息肉组织,用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)进行刺激,使用qRT-PCR、Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测mRNA、蛋白和上清胶原表达情况。结果·与CRSsNP组相比,CRSwNP组中TGF-β1、Smad2/3的蛋白和mRNA表达均降低(均P<0.05)。在所有CRS中,TGF-β1与pSmad2/3的蛋白表达呈正相关(r=0.991,P<0.01),与Smad2、Smad3mRNA表达均呈正相关(r=0.581,r=0.658,均P<0.01),与胶原表达呈正相关(r=0.982,P<0.01)。在体外培养的鼻息肉中,TGF-β1能促进pSmad2/3、Smad2、Smad3和胶原的表达。结论·TGF-β1/Smads通路在CRSwNP的组织重构中有重要作用,可能是鼻息肉胶原减少、组织水肿的重要原因之一。

左卡尼汀通过TGF-β_(1)/Smad通路对尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢的影响

目的探讨左卡尼汀通过转化生长因子-β_(1)/Sma和Mad相关蛋白(TGF-β_(1)/Smad)信号通路对尿毒症腹膜透析大鼠钙磷代谢的影响。方法将尿毒症腹膜透析大鼠分为模型组和左卡尼汀组,另给予假手术的大鼠作为对照组,每组10只。模型组和对照组分别灌胃生理盐水,左卡尼汀组灌胃左卡尼汀40 mg/kg,1次/d,持续6周。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血尿素氮、肌酐、甲状旁腺激素及钙、磷水平。采用Western blotting检测肾组织TGF-β_(1)、Smad及磷酸化Smad3(p-Smad3)蛋白相对表达量。结果模型复制前3组大鼠体重比较,差异无统计学意义(P>0.05)。模型复制6周后,与对照组比较,模型组和左卡尼汀组大鼠血肌酐、尿素氮、甲状旁腺激素及磷水平均升高(P<0.05),血钙水平降低(P<0.05),与模型组比较,左卡尼汀组大鼠血肌酐、尿素氮、甲状旁腺激素及磷水平均降低(P<0.05),血钙水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组和左卡尼汀组大鼠TGF-β_(1)和p-Smad3蛋白相对表达量均上调(P<0.05),与模型组比较,左卡尼汀组大鼠TGF-β_(1)和p-Smad3蛋白表达水平均下调(P<0.05)。结论左卡尼汀可通过抑制尿毒症腹膜透析的TGF-β_(1)/Smad通路活化来改善肾脏功能,提高血甲状旁腺激素、钙、磷水平,改善钙磷代谢平衡。

麦冬皂苷B对人结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的探讨麦冬皂苷B(OPB)对人结肠癌SW620细胞增殖、凋亡及转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路的影响。方法采用含100 kU·L^-1青霉素、100 mg·L^-1链霉素、体积分数10%胎牛血清的RMPI-1640培养液体外培养结肠癌SW620细胞,取对数生长期细胞接种于96孔板中,细胞培养24 h后分为空白对照组、OPB低剂量组(5μmol·L^-1)、OPB中剂量组(10μmol·L^-1)和OPB高剂量组(20μmol·L^-1),然后将各组细胞培养板移入培养箱中继续培养。取各组培养24、48、72 h的SW620细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测SW620的细胞抑制率。取各组培养48 h的SW620细胞,采用流式细胞术检测SW620细胞周期及凋亡情况,酶联免疫吸附试验法检测SW620细胞中TGF-β1蛋白的表达,Western blot法检测SW620细胞中磷酸化Smad3(p-Smad3)、Smad4及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的表达。结果OPB低、中、高剂量组SW620细胞抑制率显著高于空白对照组(P<0.05),OPB中、高剂量组SW620细胞抑制率显著高于OPB低剂量组(P<0.05),OPB高剂量组SW620细胞抑制率显著高于OPB中剂量组(P<0.05)。与空白对照组比较,OPB低、中、高剂量组G 2/M期SW620细胞比例下降,G 0/G 1和S期SW620细胞比例升高(P<0.05)。与OPB低剂量组比较,OPB中、高剂量组G 2/M期SW620细胞比例降低,G 0/G 1和S期SW620细胞比例升高(P<0.05);与OPB中剂量组比较,OPB高剂量组G 2/M期SW620细胞比例降低,G 0/G 1和S期SW620细胞比例升高(P<0.05)。OPB低、中、高剂量组SW620细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.05),OPB中、高剂量组SW620细胞凋亡率显著高于OPB低剂量组(P<0.05),OPB高剂量组SW620细胞凋亡率显著高于OPB中剂量组(P<0.05)。OPB低、中、高剂量组细胞培养基中TGF-β1水平低于空白对照组(P<0.05),OPB中、高剂量组细胞培养基中TGF-β1水平低于OPB低剂量组(P<0.05);OPB高剂量组细胞培养基中TGF-β1水平低于OPB中剂量组(P<0.05)。与空白对照组比较,OPB低、中、高剂量组SW620细胞中p-Smad3、Cyclin D1蛋白相对表达量显著下降,Smad4蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与OPB低剂量组比较,OPB中、高剂量组SW620细胞中p-Smad3、Cyclin D1蛋白相对表达量显著下降,Smad4蛋白相对表达量显著升高(P<0.05);与OPB中剂量组比较,OPB高剂量组SW620细胞中p-Smad3、Cyclin D1蛋白相对表达量显著下降,Smad4蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。结论OPB可明显抑制人结肠癌SW620细胞增殖,其机制可能与OPB阻滞TGF-β1/Smad信号通路有关。

罗格列酮对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响及机制探讨

目的观察罗格列酮对高脂血症大鼠血管平滑肌细胞凋亡及磷酸化Smad2/3表达的影响。方法高脂饮食复制SD大鼠高脂血症模型,酶消化法原代提取SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞进行体外培养,取5～8代细胞进行实验。无血清培养24h后:实验一分为4组:①对照组,②罗格列酮组(本实验所用罗格列酮均为100μmol/L),③罗格列酮+过氧化物酶体增生激活受体γ(PPAR-γ)阻断剂GW9662组,④罗格列酮+抗转化生长因子β1(anti-TGF-β1)组,分别用Westernblot于1h检测磷酸化Smad2/3水平,24h后流式细胞学检测细胞凋亡;实验二分2组:①对照组,②100μmol/L罗格列酮组,分别于0、0.5、1、2、6、12和24h,用Western-blot检测磷酸化Smad2/3水平。结果 24h后罗格列酮组细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.05),罗格列酮+GW9662组和罗格列酮+抗转化生长因子β1组细胞凋亡率较罗格列酮组明显降低(P<0.05);罗格列酮处理后0.5hVSMCp-Smad2/3表达水平明显高于对照组(P<0.05),且1h达高峰(P<0.05),p-Smad2/3水平达到高峰后又较快下降(P<0.05);罗格列酮+GW9662组和罗格列酮+anti-TGF-β1组p-Smad2/3表达水平较罗格列酮组低(P<0.05)。结论罗格列酮可能通过激活过氧化物酶体增生激活受体γ,诱导血管平滑肌细胞磷酸化Smad2/3表达水平上调从而诱导血管平滑肌细胞凋亡。

皮肤原位再生医疗技术治疗大鼠糖尿病足溃疡创面的效果及作用机制

目的探讨皮肤原位再生医疗技术(MEBT/MEBO)治疗大鼠糖尿病足溃疡创面的效果及对转化生长因子(TGF)-β1、磷酸化smad3(P-smad3)、β-catenin mRNA表达的影响。方法选取50只SPF级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、模型对照组、MEBT/MEBO组、贝复济组,各10只。比较四组大鼠治疗8 d的创面愈合率、平均创面愈合时间及TGF-β1蛋白、P-smad3蛋白、β-catenin mRNA的表达。结果正常对照组、MEBT/MEBO组、贝复济组的平均创面愈合时间都低于模型对照组,模型对照组治疗8 d的创面愈合率低于正常对照组、MEBT/MEBO组、贝复济组(P<0. 05); MEBT/MEBO组的平均创面愈合时间低于贝复济组,但高于正常对照组(P<0. 05)。模型对照组的TGF-β1、P-smad3蛋白表达及β-catenin mRNA表达均低于正常对照组、MEBT/MEBO组、贝复济组(P<0. 05),MEBT/MEBO组的TGF-β1、P-smad3蛋白表达低于正常对照组(P<0. 05)。MEBT/MEBO组的β-catenin mRNA表达高于贝复济组(P<0. 05)。结论 MEBT/MEBO可增强TGF-β1、P-smad3蛋白及β-catenin mRNA的表达,这可能是MEBT/MEBO治疗糖尿病足溃疡的作用机制。

重组人激活素A调节人脂肪干细胞中内胚层特异性转录因子表达的机制

目的研究重组人激活素A(activin A)调节人脂肪干细胞(human adipose stem cells,h ASCs)中内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2表达的机制。方法将h ASCs分为对照组、activin A组和activin A+SIS3组,分别给予相应处理。用免疫细胞化学法和高内涵分析系统测定各组细胞中磷酸化smad3蛋白(p-smad3)、限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的蛋白水平表达情况,用实时定量PCR法测定GATA4和FOXA2的mRNA水平表达情况。结果分组处理细胞30 min,activin A组细胞细胞核中p-smad3的表达显著高于对照组和activin A+SIS3组(P<0.05);分组处理细胞72 h,activin A组细胞中GATA4和FOXA2的mRNA和蛋白表达显著高于对照组和activin A+SIS3组(P<0.05)。结论 activin A可活化h ASCs细胞内的p-smad3信号,并促进限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的表达;p-smad3的特异性抑制剂SIS3可阻断activin A对h ASCs中p-smad3、GATA4和FOXA2的调节作用。activin A调节h ASCs中限定性内胚层特异性转录因子GATA4和FOXA2的表达依赖于p-smad3信号。

IgA肾病患者血清IgA1对人肾小球系膜细胞转化生长因子β1／Smads信号通路的影响

目的研究IgA肾病（IgAN）患者血清IgA1对人肾小球系膜细胞（HMC）转化生长因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad3（p-Smad3）和纤连蛋白（FN）的刺激作用，探讨IgA1对TGF-β1／Smads信号通路的影响。方法体外培养HMC，分5组，即健康对照组、健康人IgA1（NIgA1）刺激组、健康人聚合IgA1（aNlgA1）刺激组、IgAN患者IgA1（PIgA1）刺激组和IgAN患者聚合IgA1（aPIgA1）刺激组。RT—PCR检测各组细胞TGF-β1、p-Smad3和FNmRNA的表达。Western免疫印迹检测HMCp-Smad3蛋白水平。ELISA检测HMC培养上清液中TGF-β1、FN蛋白水平。结果PIgA1和aPIgA1能显著上调TGF-β1，P—Smad3、FNmRNA和蛋白的表达（P〈0．05）。aPIgA1上调二三者mRNA表达的能力分别为PIgA1的1．5倍、1．3倍和1．5倍（均P〈0．05）。aPIgA1上调TGF-β1和p-Smad3蛋白表达的能力分别为PIgA1的2．1倍和1．6倍（均P〈0．01）。在aPlgA1刺激不同时间，TGF-β1和p-Smad3mRNA表达于12h达高峰（0．866±0．055和0．891±0．251），于24h同到基线水平。FNmRNA表达于24h达高峰（0．968＋0．031）。TGF-β1和p-Smad3蛋白表达逐渐升高，TGF-β1于12h达高峰[（246．960±1．270）ng/L]，p-Smad3于6h达高峰（0．490±0．046）后开始下降。FN蛋白表达逐渐升高，24h达高峰[（1．804±0．038）mg／L]（均P〈0．01）。结论PIgA1和aPIgA1能显著上调HMCTGF-β1、p-Smad3、和FNmRNA表达和蛋白水平，且aPIgA1的作用强于PIgA1，提示IgAN患者血清的IgA1，主要是aIgA1可通过TGF-β1／Smads信号通路在IgAN进展中起作用。