肝纤维化大鼠星状细胞Smad3、Smad7基因表达差异的研究

通过检测肝纤维化大鼠原代肝星状细胞 (HSC)的 Sm ad3和 Smad7编码基因的表达 ,探讨 HSC活化及转化机制。皮下注射四氯化碳 (CCl4)制备大鼠肝纤维化模型 ,于注射 CCl4后 1、 4、 8周分批分离 HSC并计算 HSC平均得率 ;RT- PCR检测其 Sm ad3、Smad7m RNA的表达变化。结果显示 :1CCl4注射后第 1、 4、 8周大鼠 HSC平均得率分别为 :(3.34± 0 .36 )× 10 7/只、 (4 .2 1± 0 .6 4)× 10 7/只、 (5 .88± 0 .79)× 10 7/只 ,均高于正常大鼠 HSC平均得率(2 .2 3± 0 .19)× 10 7/只 ,组间比较有显著性差异 ,P<0 .0 5。 2与正常对照组相比 ,注射 CCl4后 1、 4、 8周大鼠 HSC中 Sm ad3m RNA表达增加 ,P<0 .0 5。注射 CCl4后 1周 Sm ad7m RNA较正常明显升高 ,P<0 .0 5 ,到第 4周和第 8周表达水平则持续下降 ,P<0 .0 1。提示 Sm ad3和 Smad7在肝纤维化发生、发展中对 HSC的活化及转化起不同的介导作用。

Smad7基因在细胞恶性转化过程中的促增殖作用

用基因转染的方法,建立稳定表达Smad7基因的永生化及恶性化人支气管上皮细胞系,用MTT法检测Smad7基因过表达对细胞生长、增殖的影响及对TGF β1介导的生长抑制效应的影响.结果表明在永生化和恶性化人支气管上皮细胞系BEP2D和BERP35T2中各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的克隆,命名为BS7 1、BS7 2(来源于BEP2D),RS7 1、RS7 2(来源于BERP35T2).这些细胞系细胞的生长、增殖能力均强于转染空载体的对照细胞系,同时TGF β1对这些细胞系的生长抑制能力明显减弱.提示Smad7基因通过降低细胞对TGF β的应答来促进细胞的生长、增殖能力.

TGFβ1对转染Smad4/Smad7基因的大鼠系膜细胞Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响

目的 探讨Smad4 /Smad7信号蛋白在转化生长因子β1(TGFβ1)作用下对大鼠系膜细胞 (MsC)Ⅰ、Ⅳ型胶原表达的影响。方法 经脂质体介导分别将Smad4 /Smad7基因瞬时转染体外培养的大鼠MsC ,并用免疫荧光、RT PCR和Westernblot法检测其转染成功与否 ;再用Westernblot法分别观察转基因MsC及其在TGFβ1作用下 ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达的改变。结果 与转染空载体的MsC相比较 ,转染Smad4基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别增强 1.2和 1.8倍 ,经TGFβ1作用后升高 1.8和 3.3倍 (P <0 .0 1) ;而转染Smad7基因的MsC ,其Ⅰ、Ⅳ型胶原蛋白表达分别下降 1.4和 1.9倍 ,经TGFβ1作用后则降低 1.7和 2 .4倍 (P <0 .0 1)。 结论 TGFβ1/Smad信号通路可从正反两方面调节MsCⅠ。

转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI-1表达的改变

目的 通过对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MsC)转染Smad7基因,观察转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1表达的改变,以进一步阐明Smad7阻断组织纤维化过程的作用机制。方法 经脂质体介导将含有Smad7重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及RT-PCR、Western blot法鉴定;又分别采用RT-PCR与Western blot法,检测转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1表达改变。结果 成功建立高表达Smad7的阳性MsC克隆(S-22、S-26),并证实其uPA mRNA及蛋白表达明显增加,而PAI-1 mRNA及其蛋白的表达显著下降。结论 Smad7可能通过增强组织内uPA酶的生成和减少PAI-1的合成而减轻组织纤维化进展。

转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞MMP-2、uPA及Col Ⅳ表达的改变

目的 通过大鼠肾小球系膜细胞 (mesangialcell,MsC)转染Smad7基因 ,观察转基因MsCMMP 2、uPA和ColⅣ表达的改变 ,以阐明Smad7在肾小球硬化发生中的作用及其机制。方法 经脂质体介导将含有Smad7重组表达质粒转染大鼠MsC ,用G4 18筛选及Westernblot、RT PCR法鉴定 ;采用Westernblot、酶谱分析和RT PCR法 ,检测转染阳性MsC克隆MMP 2、uPA和ColⅣ表达改变。结果 成功建立高表达Smad7的阳性MsC克隆 (S 2 2 ,S 2 6 ) ,并证实其MMP 2蛋白分泌和酶活性明显增加 ,以及uPAmRNA及其蛋白的表达明显增强 ,并伴有MsCColⅣ合成的显著下降。结论 Smad7可能通过增强MsCMMP 2。

Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响

目的观察外源Smad7基因对L0 2肝细胞株增殖活性的影响。方法分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP在体外感染L0 2肝细胞 ,以RT PCR和Western blot检测外源Smad7基因表达情况 ,MTT法检测L0 2肝细胞增殖活性 ,流式细胞仪检测其细胞周期变化。结果AdSmad7体外感染L0 2肝细胞后 ,Smad7mRNA和蛋白水平均显著上调。转化生长因子 β(TGFβ)可抑制L0 2细胞增殖 ,诱导其凋亡。导入外源Smad7可拮抗TGFβ的作用。结论利用AdSmad7导入外源Smad7基因可间接促进肝细胞增殖 。

RNA干扰对Smad7基因的抑制作用

小分子干扰RNA(siRNAs)可以高效、特异地阻断体内同源基因的表达,促进同源mRNA降解,称为RNA干扰(RNAi)。本研究旨在探讨Smad7基因的siRNAs是否能抑制基因的表达。利用RNA干扰技术,设计并合成了针对Smad7基因的siRNAs,用脂质体转染法瞬时转染BEP2D和BERP35T2细胞,用Northernblot法检测RNAi效应;同时设计并合成了绿色荧光蛋白(GFP)的siRNAs,瞬时转染稳定表达绿色荧光蛋白的BERP35T2细胞,检测荧光强度有无改变。结果表明RNA干扰技术能明显抑制Smad7基因的表达,并能显著减弱绿色荧光的表达强度,为进一步研究Smad7基因功能及TGF-β信号转导通路奠定了基础。

Smad7基因的克隆、表达及对c-myc基因的调控

Smad7是TGF-β家族信号转导通路的抑制分子,可反馈调节TGF-β/Smads信号转导通路,从功能推测,Smad7表达紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性化进展,为了深入探讨Smad7基因功能,通过设计引物,用Touchdown巢式-PCR法从人胎脑文库中扩增Smad7基因编码区全长,回收产物,克隆并构建真核表达载体,同融合有报告基因的c-myc顺式增强子元件共转染BEP2D细胞,结果表明:TGF-β可抑制c-myc报告基因的活性,Smad7基因可正调控c-myc报告基因的表达,并拮抗TGF-β对该基因的抑制作用.由此得出结论:Smad7基因通过拮抗TGF-β来调控c-myc基因.

TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测

采用肾小管节段贴块法培养小鼠原代肾小管上皮细胞,用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞种类,并用RT-PCR检测了原代肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7基因的表达情况。结果表明,TGF-β1、Smad4和Smad7基因在肾小管上皮细胞中均有表达。这为探讨上述基因在肾间质纤维化中的作用奠定了基础。

Smad7基因与肾间质纤维化

肾间质纤维化（renal-interstitial fibrosis，IKIF）是由各种肾脏损害因素导致细胞外基质在肾间质内过度沉积的病理过程，是各种肾脏疾病发展到肾功能衰竭的共同通路和病理基础。因此，研究RIF的发病机制、干预RIF的进程是当前肾脏病界的研究热点。在RIF的各种发生机制中，转化生长因子β（tramforming growth factor～β，TGF～β）过度表达致肾纤维化的作用备受关注。TGF-β在RIF发生过程的多个阶段发挥了重要作用，是肾脏纤维化发生、发展中的关键因子。

含Egr-1启动子和Smad7基因的重组腺病毒的构建

目的 :构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并初步验证其活性 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 :以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,再将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,然后与腺病毒DNA重组 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α ,PCR鉴定正确即为pAdES。脂质体法转染HEK2 93细胞 ,包装出完整腺病毒 ,然后大量扩增测定滴度。重组腺病毒感染成纤维细胞 (3T6 ) ,经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位。结果 :经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 1.0× 10 11TCID50 /ml。细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞质内。结论 :利用Adeno XTM 表达试剂盒 ,通过分子克隆体外重组技术可以方便的构建重组腺病毒载体 ,并能在HEK2 93细胞内成功包装和扩增。

TGF-β／Smad信号通路中TGF—β1和Smad7基因在结肠癌中的表达

目的通过检测TGF—β／Smad信号通路中的TGF—β1及Smad7基因在结肠癌癌组织中的表达，探讨的关系研究它们与结肠癌发生、发展的关系。方法本研究以人结肠癌病例标本作为研究对象，采用免疫组化S-P二步法对40例不同时期结肠癌组织检测。结果TGF—β1在结肠癌阳性率为70％（26／40），smad7在结肠癌阳性率为75％（28/40），不同性别、年龄中二者表达无统计学意义（P〉0．05），在淋巴结转移、分化程度、Dukes分期相关差异有统计学意义（P〈0．05），两者有相关性。结论TGF—β1和Smad7在结肠癌发生、发展中具有重要协同作用。可作为结肠癌诊断的辅助指标。

基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究

本文旨在探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用。用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),脂质体介导瞬时转染BERP35T-2肺癌细胞系,Northemblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对两个不同靶序列的siRNAs,Northemblot杂交显示,在转染siRNA和BERP35T-2细胞中,不管是内源性的还是外源性的Smad7mRNA的表达丰度均明显下降,Smad7基因编码区中542bp～563bp及701bp～722bp两个区域均是siRNA作用的有效靶序列;本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制smad7基因的表达。

SMAD7基因rs4939827位点多态性对下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的影响

下肢动脉粥样硬化闭塞症(arteriosclerosis obli-terans of the lower limbs,ASO)是由于下肢动脉粥样硬化斑块导致动脉管腔变窄,出现下肢缺血症状的疾病[1],随着人口老龄化,ASO的发病率和死亡率逐年增高,严重威胁人类健康。下肢动脉经皮腔内血管成形术(PTA)+支架植入术(STENT)是ASO的重要治疗手段,但术后有较高比例的患者发生动脉再狭窄,严重影响PTA+STENT术的疗效和患者的长期预后[2]。研究显示,SMAD7在抗血管壁纤维化,缓解动脉粥样硬化进程中发挥重要作用[3]。本研究旨在探究SMAD7基因rs4939827位点多态性与下肢动脉PTA+STENT术后再狭窄的关系。

Smad7基因过表达的促增殖作用机制探讨

目的 研究Smad7过表达使人支气管上皮细胞系增殖能力增强的机制。方法 用Smad7真核表达载体PCISmad7.neo同携带有报告基因碱性磷酸酶的c myc顺式增强子元件pMyc SEAP共转染 ,检测Smad7基因对增殖信号通路的影响。用RT PCR方法 ,检测稳定转染Smad7基因前后永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系BEP2D和BERP35T2细胞内c myc、p15、p2 1表达水平的变化 ,调查Smad7基因对TGF β介导的抗增殖基因反应的调控。 结果 报告基因检测结果表明 ,Smad7基因可使参与增殖信号通路的c myc顺式增强子元件活性增强。RT PCR结果表明 ,在稳定转染Smad7基因的细胞中 ,c myc表达上调 ,p15表达降低 ,对TGF β刺激的应答丧失 ,p2 1表达降低。 结论Smad7基因可通过调控TGF β介导的抗增殖基因应答来影响细胞的生长。

Smad6和Smad7基因治疗对肾小管间质纤维化进程的影响

目的观察腺相关病毒(rAAV)介导的Smad6和Smad7基因治疗对单侧输尿管梗阻性(UUO)肾小管间质纤维化进程的影响。方法构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体,再将此病毒颗粒通过肾动脉途径转移到UUO模型。30只Wistar大鼠随机分为假手术组、梗阻组、LacZAAV转染组、Smad6AAV转染组和Smad7AAV转染组(n=6),于术后第3周处死大鼠。采用β-半乳糖苷酶染色和免疫组化观察外源基因的定位,Western印迹法观察外源基因、胞内磷酸化Smad2、PAI-1和α-SMA的表达;底物酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性,分光光度法测定肾组织羟脯氨酸含量。结果Smad6和Smad7成功地转染到外髓的肾小管间质区,定位在肾小管和集合管细胞,而血管细胞、肾小球或间质细胞均未见有AAV转移基因的表达。Smad7基因治疗可显著降低肾组织PAI-1、α-SMA的表达和肾组织羟脯氨酸含量,增加MMP-2和MMP-9活性,这些作用与Smad7阻断Smad2磷酸化有关。相反,Smad6没有这样的治疗作用。结论Smad7基因转移能有效缓解单侧输尿管梗阻肾小管间质纤维化,AAV介导的Smad7基因转移有望成为治疗肾小管间质纤维化的方法之一。

外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响

目的研究外源Smad7基因对原代肝星状细胞(HSC)活性和基因表达调控的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC,并予转化生长因子β1(TGFβ1)刺激,同时分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP感染原代HSC,RTPCR法检测TGFβ1、Smad3mRNA、Smad7mRNA在HSC中的表达,免疫细胞化学法检测HSC中α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和Smad7表达。结果RTPCR显示,与TGFβ1对照组比较,AdSmad7组Smad7mRNA表达显著上调(P<0.05),但TGFβ1和Smad3mRNA表达差异无统计学意义。免疫细胞化学染色显示,与其他各组比较,AdSmad7组HSC胞质中Smad7表达最高,αSMA表达则明显降低(P<0.01)。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7可在HSC中高效表达;外源Smad7基因可阻断TGFβ1对HSC的活化作用,但对Smad3和TGFβ1mRNA表达无明显影响。

超声联合血清MYCN、Smad7 mRNA检测对神经母细胞瘤的诊断价值

目的:探讨彩色多普勒超声联合血清MYCN、Smad7 mRNA检测在诊断儿童神经母细胞瘤中的临床价值。方法:选取确诊的48例神经母细胞瘤患儿为神经母细胞瘤组,同期选取因腹胀、腹泻、便秘、呕吐等原因就诊最终排除神经母细胞瘤的患儿50例作为对照组,对其均行彩色多普勒超声检查。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA对神经母细胞瘤的诊断效能,采用一致性Kappa检验分析各诊断方法与手术或穿刺病理结果的一致性。结果:神经母细胞瘤组血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平显著高于对照组(均P<0.05)。血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA诊断神经母细胞瘤的曲线下面积(AUC)分别为0.867(95%CI:0.795~0.938)、0.818(95%CI:0.734~0.901),特异度分别为88.00%、84.00%,灵敏度均为75.00%。超声检查结果中假阳性8例,假阴性11例,与手术或穿刺病理结果的一致性较高,Kappa值为0.612(P<0.05);超声联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA检查结果中假阳性9例,假阴性4例,与手术或穿刺病理结果的一致性较高,Kappa值为0.735(P<0.05)。超声联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA诊断神经母细胞瘤的灵敏度显著高于三者单独诊断(P<0.05)。结论:超声检查对儿童神经母细胞瘤有较高的诊断价值,其联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA后诊断价值有一定的提高。