半导体量子点单克隆抗体荧光探针对牙乳头细胞内Smad4信号蛋白分子核移位过程的检测

目的:制备半导体量子点-Smad4单克隆抗体荧光探针(Semiconductor quantumdots,QDS-Smad4),并用其对大鼠牙乳头细胞内Smad4蛋白分子在TGF-β1的刺激下发生的核移位过程进行检测。方法:①用化学偶连法制备水溶性的QDS-Smad4单抗荧光探针并纯化;②测定QDS-Smad4单抗荧光探针的吸收光谱、发射光谱并用激光共聚焦显微镜对QDS-Smad4单抗荧光探针的光学性质进行检测;③采用SP免疫组化法、QDS直接标记法、Smad4单抗直接标记法和QDS-Smad4单抗荧光探针直接免疫荧光成像法比较观察QDS-Smad4单抗荧光探针对大鼠牙乳头细胞内Smad4的特异性识别能力,并检测细胞内QDS-Smad4单抗荧光探针的光学性质;④在大鼠牙乳头细胞内加入TGF-β1,分别于加入前、加入后12h和24h,采用SP免疫组化法和QDS-Smad4单抗荧光探针直接免疫荧光成像法观察比较Smad4在细胞内发生核移位的动态变化。结果:半导体量子点与Smad4单抗通过共价结合形成稳定的QDS-Smad4单抗荧光探针,QDS-Smad4单抗荧光探针对大鼠牙乳头细胞内Smad4分子仍具有特异性的免疫识别能力,能成像显示Smad4所产生核移位的动态变化;QDS-Smad4单抗荧光探针仍具有QDS所具有的激发光谱宽,发射光谱窄,荧光度强,光化学稳定性好等光学特征。结论:半导体量子点和单抗共价结合形成分子探针后仍具有独特的光学性质和特异免疫识别能力,能长时间对细胞内蛋白质分子进行成像标记,这为半导体量子点用于可视化研究活细胞内蛋白质分子的运动和相互作用等过程提供了科学依据。

Smad4和转化生长因子-β_1在肝细胞癌组织芯片中的表达和意义

目的研究Smad4和转化生长因子-β(1TGF-β1)在肝细胞癌组织芯片中的表达和意义。方法使用组织芯片技术,选取200例肝细胞癌患者癌组织及癌旁肝组织,32例肝血管瘤患者瘤旁正常肝组织进行对照,分别进行Smad4和TGF-β1免疫组织化学染色,在显微镜下观察其表达的阳性率。结果 Smad4在对照组肝组织、癌旁肝组织、肝细胞癌中的表达呈逐渐下降的趋势,即Smad4在癌组织中表达有缺失,差异有统计学意义。在表达强度上,癌旁肝组织以强阳性表达为主,肝细胞癌中主要以弱阳性表达为主。TGF-β1在癌旁肝组织中的阳性表达率为96%,高于对照组,但在肝细胞癌中的阳性表达率降低为49.5%。对照组肝组织中的TGF-β1表达以弱阳性为主,占40.6%,在癌旁肝组织中以中度阳性为主,占51.5%,在肝细胞癌组,以阴性表达为主,占50.5%。由对照组到癌旁组织到肝细胞癌组,TGF-β1的表达呈现先升后降的趋势。结论 Smad4、TGF-β1与肝细胞癌的发生和肿瘤的生物学行为密切相关,TGF-β1可能作为肿瘤抑制因子和促进因子,发挥双向调节作用,缺失导致肝细胞癌发生,但过高表达可能使肿瘤细胞侵袭能力加强。

TGF-β1／Smads信号通路介导支气管上皮细胞分泌型白细胞蛋白酶抑制因子下调

目的探讨支气管上皮细胞分泌型白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）表达下调与TGF-βl／Smads信号通路的关系。方法将人正常支气管上皮HBE细胞分为正常对照组、转化生长因子β1（TGF-β1）刺激组（刺激组）、Smad4小分子干扰RNA（siRNA）预处理后再行TGF-β1刺激组（干扰组）、阴性对照siRNA预处理后再行TGF-β1刺激组（干扰对照组），采用免疫细胞化学及蛋白质印迹法检测各组细胞中Smadd、SLPI的表达，反转录聚合酶链反应法检测各组细胞中Smad4 mRNA及SLPI mRNA的表达。每次试验每组各取1孔细胞，每项检测各重复4次。结果刺激组HBE细胞中Smadd蛋白及mRNA表达水平（分别为1．18±0．17、1．33±0．16）明显高于而SLPI蛋白及mRNA表达水平（分别为0、17±0．10、0、11±0．05）明显低于正常对照组（分别为0．29±0．06、0、31±0．07、1．29±0、21、0．83±0．13，均P〈0．01）和干扰组（分别为0、27±0．08、0．34±0．09、1．22±0．18、0．81±0．11，均P〈0．01），干扰对照组Smadd和SLPI表达水平与刺激组比较差异无统计学意义。结论TGF-β1可促使支气管上皮细胞SLPI表达下调，其作用可能是通过TGF-β1／Smads信号通路介导的。

Smad4表达异常与结直肠癌的相关性研究

目的探讨结直肠组织Smad4 mRNA及其蛋白表达水平变化、Smad4基因CpG岛异常甲基化与结直肠癌及其临床病理特征的关联性。方法应用RT-PCR方法及测序、半定量RT-PCR方法、甲基化特异性PCR（MSP）技术和免疫组织化学方法，各自检测43例患者的结直肠癌组织、癌旁组织及30例结直肠腺瘤组织、12例健康人结肠黏膜组织。结果43例结直肠癌组织中有25例（58．14％）Smad4 mRNA检测到阳性表达，其阳性表达率（58．14％）及表达水平（0．73±0．25）均低于相应的癌旁组织（88．37％，0.95±0．29）、腺瘤组织（90．63％，1、01±0．37）和健康人黏膜组织（100．00％，1.18±0.33），差异均有统计学意义（P〈0.05）。Smad4基因启动子甲基化阳性率结直肠癌组织（60．53％）明显高于癌旁组织（27．03％）、腺瘤组织（25．00％）和健康人黏膜组织（16.67％），差异均有统计学意义（P〈0．05）。Smad4蛋白表达的阳性率结直肠癌组织（44.19％）明显低于癌旁组织（81．40％）、腺瘤组织（87．50％）和健康人黏膜组织（91．67％），差异均有统计学意义（P〈0.05），并随着浸润深度加深和淋巴结转移，阳性率也随之下降。结论Smad4的低表达与结直肠癌的发展、生物学行为和预后可能有关，可作为重要的生物学标志及病期评估的标志之一。