1,25-(OH)_(2)-VitD3通过抑制Snail1-SMAD3/SMAD4复合物形成减轻糖尿病肾病肾小管间质纤维化

目的研究1,25-(OH)2-VitD3(VitD3)对糖尿病肾病肾小管间质纤维化的影响.方法NRK-52E肾小管上皮细胞分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖培养基处理)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖的培养基处理)和高糖加VitD3组(25 mmol/L葡萄糖培养基联合10-8 mol/L VitD3).实时定量PCR和Western blot法分别检测NRK-52E细胞Snail家族转录抑制物1(Snail1)、SMAD家族成员3(SMAD3)、SMAD4、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的mRNA和蛋白表达;免疫荧光细胞化学染色检测Snail1、SMAD3、SMAD4的表达及定位;通过染色质免疫沉淀检测Snail1与SMAD3/SMAD4形成的复合物与柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)的启动子结合情况;荧光素酶报告检测Snail1、SMAD3/SMAD4和E-cadherin的相互作用;采用小干扰RNA(siRNA)抑制细胞Snail1、SMAD4的表达后,通过实时定量PCR检测E-cadherin的mRNA表达.SD大鼠随机分为对照组、DKD组和VitD3处理组.DKD组和VitD3处理组通过注射链脲佐菌素(STZ)先制备DKD模型,DKD造模成功后,VitD3处理组予60ng/kgVitD3灌胃,对照组和DKD组给予生理盐水灌胃;DKD组和VitD3处理组同时皮下注射胰岛素(1~2)U/kg控制血糖,持续8周.采用实时定量PCR和Western blot法分别检测肾组织中Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA、E-cadherin的mRNA和蛋白水平,免疫组织化学检测肾组织Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA和E-cadherin的表达及定位.结果与对照组相比,高糖处理的NRK-52E细胞及DKD肾组织Snail1、SMAD3、SMAD4和α-SMA的mRNA和蛋白表达均上调,E-cadherin表达下调;给予VitD3干预后,DKD模型中Snail1、SMAD3、SMAD4、α-SMA和E-cadherin的表达水平恢复到与对照组接近.染色质免疫沉淀提示Snail1、SMAD3/SMAD4与CAR的启动子Ⅳ结合,而VitD3能够阻止Snail1、SMAD3/SMAD4与CAR的启动子Ⅳ结合;荧光素酶报告检测证实Snail1、SMAD3/SMAD4和E-cadherin的互作关系;用siRNA抑制Snail1、SMAD4的mRNA后,上调高糖诱导下E-cadherin的表达.结论VitD3可抑制Snail1-SMAD3/SMAD4的复合物的形成,减轻糖尿病肾病肾小管间质纤维化.

γ射线对肺成纤维细胞中转录因子SP1,AP1和Smad3-Smad4活性的影响及意义

目的检测不同剂量γ射线照射对大鼠肺成纤维细胞(ratlungfibroblast,RLF)中转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4活性的影响并探讨其意义。方法进行大鼠肺成纤维细胞的原代分离培养,应用3、5和8Gyγ射线照射,通过凝胶阻滞电泳(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)、免疫印迹和免疫组织化学等方法检测照射后转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4活性的变化及Ⅰ型胶原和Ⅰ型组织纤溶酶原激活物抑制剂(typeⅠplasminogenactivatorinhibitor,PAIⅠ)的表达变化。结果正常RLF中AP1和Smad3Smad4形成弱阻滞条带,SP1无阻滞条带形成,3、5和8Gyγ射线照射后,3种转录因子所形成的阻滞条带明显增强,PAIⅠ和Ⅰ型胶原的表达增多。结论一定剂量γ射线能促进大鼠肺成纤维细胞中转录因子SP1,AP1和Smad3Smad4的活化,并进而促进PAIⅠ和Ⅰ型胶原的表达。