水牛Sohlh2基因的克隆分析及其表达

为阐明广西沼泽型水牛Sohlh2基因在水牛不同组织中的表达规律,根据Gen Bank已公布的牛Sohlh2基因序列,设计其编码区(CDS)扩增引物,应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析了水牛Sohlh2的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用RT-QPCR技术对Sohlh2基因在水牛组织(器官)的表达进行了分析。结果表明:水牛Sohlh2基因编码区全长1 281 bp,共编码426个氨基酸。多重序列比较分析结果显示水牛Sohlh2核苷酸序列与牛、绵羊、山羊、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为98%、96%、96%、85%、86%、81%和72%,系统进化树显示Sohlh2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。Sohlh2蛋白质呈弱碱性,无信号肽,在细胞中亚定位于细胞核中,存在b HLH结构。水牛Sohlh2基因在水牛垂体、大脑、肝脏、骨骼、卵巢和睾丸等11个组织(器官)细胞中具有不同程度的表达,其中睾丸细胞中表达量最高,垂体和生殖脊细胞中表达量次之,卵丘细胞中表达量低,心脏、肺脏、肌肉细胞和颗粒细胞中不表达。

生殖细胞特异性基因SOHLH1与SOHLH2的研究进展

SOHLH1与SOHLH2属于基础型螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,具有生殖细胞的特异性,在生殖细胞分化及发育早期发挥着重要作用。本文就SOHLH1与SOHLH2的进化、表达及调控机制进行综述,为未来人类生殖相关疾病的研究及治疗提供理论基础。

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控作用。方法取出生3d的雌性昆明小鼠卵巢,采用两步酶消化法,分离纯化卵母细胞,进行原代培养。将卵母细胞分为3组:正常对照组(Con组)、添加重组人BMP4组(BMP4组)、添加BMP4和BMP4抑制剂6-{4-[2-(1-呱啶基)乙氧基]苯基}-3-(4-吡啶基)吡唑并(1,5-A)嘧啶(dorsomorphin)组(BMP4+抑制剂组)。采用TUNEL法,检测BMP4对卵母细胞凋亡的影响;采用免疫组织化学染色与实时定量PCR,检测BMP4对卵母细胞中p-Smad1/5/8、sohlh2、ckit及foxo3a表达的影响。采用RNA干扰技术、转染sohlh2质粒和LY294002处理,探讨BMP4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控机制。结果 TUNEL结果显示,BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于Con组(P<0.05)和BMP4+抑制剂组(P<0.05);加入BMP4可明显促进细胞Smad入核,上调sohlh2和c-kit表达,抑制foxo3a入核;转染sohlh2 siRNA后,可明显阻断BMP4抑制卵母细胞凋亡的作用;转染sohlh2质粒后,p-foxo3a表达量显著增加,LY294002可明显抑制sohlh2促进foxo3a磷酸化的作用。结论激活BMP4/Smad信号通路可抑制小鼠原始卵泡卵母细胞的凋亡,其作用机制可能是通过上调sohlh2和c-kit基因表达,进而调控foxo3a入核而实现的。

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制

目的:探讨骨形态发生蛋白4(BMP4)/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制。方法:取3日龄昆明雌性小鼠卵巢体外培养,添加重组BMP4,并以不添加BMP4为对照,采用HE染色和TUNEL法,检测BMP4在原始卵泡存活和发育中的作用;采用免疫组织化学、Westernblotting与RT-PCR检测BMP4对原始卵泡中p-Smad1/5/8、sohlh2及c-kit表达的影响。结果:①BMP4组卵巢直径明显变大(1.17±0.24 mm vs 0.65±0.13 mm,P<0.05),原始卵泡数(45.3±4.2枚)明显低于对照组(55.0±5.0枚)(P<0.05),而初级卵泡的数(25.3±2.5枚)明显多于对照组(19.0±1.0枚)(P<0.05)。②TUNEL结果显示BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。③免疫组织化学、Western blotting与RT-PCR结果显示,与对照组相比,BMP4组原始卵泡卵母细胞中p-Smad 1/5/8、Sohlh2及C-kit的表达均显著升高(P<0.01)。结论:BMP4/Smad信号通路可促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变,并抑制卵母细胞的凋亡;其可能通过上调Sohlh2及C-kit基因的表达而发挥作用。

补肾填精法通过Bmp4/Smad信号通路对小鼠原始卵泡发育的作用及机制研究

目的探讨补肾填精法通过Bmp4/Smad信号通路对小鼠原始卵泡发育的作用及机制。方法选择雌性小鼠40只,通过透明带3多肽注射建立卵巢早衰(POF)模型,并随机分为模型组和补中药组各20只,其中中药组给予补肾填精法治疗,HE染色法观察各组卵巢及卵巢切片最大截面上原始卵泡、初级卵泡的数量情况;采用TUNEL法观察各组原始卵泡中卵母细胞凋亡情况;Western blotting法检测Bmp4、Smad1、sohlh2及c-kit蛋白的表达情况。结果 HE染色结果显示,与模型组相比,中药组原始卵泡和初级卵泡数量明显增加(P<0.05);TUNEL结果显示,中药组原始卵泡中卵母细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。Western Blot结果显示,与模型组小鼠相比,中药组Bmp4、Smad1、sohlh2及c-kit蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论补肾填精法通过激活BMP4/Smad信号通路,促进小鼠原始卵泡发育,并抑制卵母细胞的凋亡,改善卵母细胞质量。