利用Solexa测序技术鉴定苋菜试管开花过程中的miRNAs

利用Solexa测序技术对苋菜试管开花过程中的miRNAs进行筛选和鉴定,使用GO数据库和KEGG代谢途径数据库对靶基因进行功能注释和分类。结果显示:共得到sRNA Unique序列5 457 486条,其中与拟南芥基因组完全匹配有27 596条,仅仅占0.51%;miRNA主要分布在18 nt^25 nt之间,其中长度为24 nt序列数量最多;苋菜试管开花过程中miRNA的表达丰度存在明显差异,主要低丰度表达;总共鉴定了235个已知的苋菜miRNA,构成20个家族,不同家族间成员数量存在巨大差异;苋菜保守miRNA的长度主要集中在21 nt和20 nt;另外总共获得14个候选的新miRNA,其中有8个miRNA含单个基因座,另6个miRNA具备多个基因座;11个候选的miRNA预测到了靶基因,总共对应着约46个基因符合靶标特征。这些靶标参与植物生物体的各个发育进程,在苋菜试管开花过程中对生物过程、细胞组分及分子功能起到重要作用。

利用Solexa测序技术发掘木薯microRNAs

为了发掘木薯中的microRNAs(miRNAs),了解其在木薯中的调控机制,利用Solexa测序技术在木薯中发现了大量的miRNAs,并利用一种新的miRNA定量检测技术(Multiplexed RT法)对其进行实验验证。通过对构建的3个小RNA文库进行Solexa测序与生物信息学分析,最终获得19个家族93个保守的miRNA和74个新的miRNA,实验验证了测序获得的83个miRNA。在Arg7块根中特异表达的有6个miRNA,分别为miR172d、miR396c、miR398a、miR398b、miR399e、miR399f,叶片中特异表达的有13个,须根中特异表达的有3个,这些miRNAs将为深入了解木薯块根发育和淀粉累积机理提供了一个新的视角。

凡纳滨对虾肠道微生物宏基因组Solexa测序及其初步分析

CTAB-酚/氯仿法提取新鲜凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道微生物宏基因组DNA。结果表明:CTAB-酚/氯仿法提取总DNA的浓度达到92.5 ng/μL,半定量PCR法检测微生物基因组相对含量为69.9%。凡纳滨对虾肠道微生物宏基因组用于Solexa测序,生物信息学分析结果显示宏基因数据中64.1%的数据属于未知序列,35.5%属于真核生物,而已知的微生物和病毒序列所占比例仅有0.4%。

基于Solexa高通量测序的黄曲条跳甲转录组学研究

黄曲条跳甲Phyllotretastriolata(Fabricius)是十字花科蔬菜的重要害虫。为深入了解其遗传信息,本研究应用新一代高通量测序技术Illumina'sSolexa平台对黄曲条跳甲成虫的转录组进行测序,并结合SOAPdenovo拼接聚类等分析软件,获取大量的EST和挖掘功能基因。本文最终获得了4924条序列重叠群(contig),其中包含2209种与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster蛋白基因具直系同源的独立基因(unigene)和610种黄曲条跳甲物种特有的unigene。结合GeneOntology(GO)数据库进行分析,发现大部分的unigene具结合能力(bindingcapability)和催化活性(catalyticactivity);上百种unigene可聚类于生物学过程分类中的配子发生、生殖腺发育和交配行为等重要功能。另外,结合KEGGPathway数据库分析发现,共有363种unigene参与或涉及了40种代谢路径,其中生物钟调控路径和植物次生代谢物路径等相关基因的发现,有助于深入研究黄曲条跳甲行为发生的内在机理。Solexa高通量测序技术作为昆虫功能基因组研究的重要手段,为发掘黄曲条跳甲功能基因发挥了重要作用,也为在分子水平上研发黄曲条跳甲的防治新策略提供了更翔实的基因信息。

Solexa测序法研究肺炎克雷伯菌质粒基因组的耐药基因

目的通过Solexa高通量测序法研究肺炎克雷伯菌的质粒与耐药性的关系。方法菌株为7年临床分离的206株肺炎克雷伯菌。提取所有菌的全部质粒DNA，Solexa高通量测序获得大规模的短序列。SOAP软件对质粒基因进行分析拼接，分析结果与相关数据库进行比对。MAQ软件分析质粒基因组包含的超广谱β-内酰胺酶（ESBL）多样性及单核苷酸多态性（SNP）情况。结果肺炎克雷伯菌质粒基因组中已知的直接与耐药相关的基因就有13种。质粒基因组中存在多个ABC主动外排转运系统。发现4种编码β-内酰胺酶的ORF，其中SHV型ESBLs分布最广。系统分析了206株肺炎克雷伯菌质粒基因组中SHV型ESBLs的SNPs位点，发现存在着大量的非同义替换SNPs位点。结论发现质粒中SHV型ESBLs基因可能受到选择压力，存在着大量的非同义替换SNPs位点。肺炎克雷伯菌质粒存在外排药物耐药方式，从而形成低水平的非特异多重耐药。

Solexa测序技术分析鸡与鹌鹑属间杂交雌性和雄性胚胎的差异microRNAs

分别从孵化3d的已鉴定性别的鸡与鹌鹑属间杂交早期雌性和雄性胚胎组织中提取小RNA,并构建各自的cDNA文库,通过Illumina/Solexa二代测序平台对两样本Small RNA进行高通量深度测序,结合生物信息学的方法对其属间杂交早期的雌性和雄性胚胎中已知的和预测的miRNAs的类型、长度、丰度以及参与的KEGG通路等进行了初步的统计和分析。结果显示,鸡与鹌鹑属间杂交早期雌性胚胎组织的比对序列有16 058 009条,雄性组织有17 943 294条;雌性胚胎预测得到132种miRNA,雄性胚胎预测得到460种miRNA;雌性和雄性样本间差异显著的miRNA有117个(P<0.01);KEGG通路分析表明,这些差异miRNAs的靶基因主要参与了Wnt信号通路、MAPK信号通路、TGF-beta信号通路等与胚胎生长发育相关的途径。结果表明,就已知的miRNAs而言,在鸡与鹌鹑属间杂交雌性和雄性胚胎间存在着一定的差异,这些差异的miRNAs将为后续的功能和调控机理实验研究提供依据。

第二代测序技术用于水稻和稻瘟菌互作早期转录组的分析

稻瘟菌为了实现对水稻的有效侵染,在侵染水稻时可能通过表达和转运一定数量的效应蛋白进入到水稻细胞,抑制和干扰水稻的先天免疫机制。文章利用Solexa第二代测序技术,通过开展水稻和稻瘟菌互作早期转录组的测定和分析,克隆和鉴定在互作早期表达的稻瘟菌效应蛋白基因。利用序列同源比对,我们从总计约12.5 M条序列标签中,分离和鉴定了338 942条来源于稻瘟菌的序列,并最终定位到779个稻瘟菌预测基因。其中108个基因很可能参与了水稻和稻瘟菌互作过程,42个基因为预测的分泌蛋白基因。通过RT-PCR分析,最终确认了42个预测分泌蛋白基因中有12个基因在侵染水稻早期有显著的表达,而其中有4个基因表现为侵染早期特异表达。文章尝试利用第二代测序技术实现稻瘟菌侵染早期特异表达基因,尤其是分泌蛋白基因的快速克隆和鉴定,为稻瘟菌效应蛋白基因的克隆和功能鉴定提供了较为有意义的探索。

绵羊不同部位脂肪组织microRNA高通量测序及生物信息学分析

本研究旨在挖掘绵羊不同脂肪组织中特异表达的miRNAs。构建肾周(PEF)、皮下(SUF)和尾部(TAF)脂肪组织的3个小RNA文库,利用Solexa测序技术进行测序,用Stem-loop qRT-PCR技术和生物信息学方法对测序结果进行验证和分析。结果表明,8个随机选择的miRNAs中有7个miRNAs的表达与测序结果一致。在肾周和皮下脂肪组织的sRNA文库中分别检测到128和112个保守miRNAs,分别发现198和196个新miRNAs。结合前期在尾脂中检测到miRNAs的分析结果,肾周脂肪中特异表达的有12个保守的和66个新miRNAs;皮下脂肪中特异表达的保守和新miRNAs分别为1个和30个;尾脂中特异表达的保守和新miRNAs分别为1个和34个。上述结果将为进一步研究miRNA调控绵羊的脂肪代谢提供科学依据。

高通量测序技术分析急性髓系白血病血浆外泌体微RNA表达谱差异

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,目前的诊断方法不利于疾病的早期发现,且诊断结果重复性较差。已有大量研究显示,细胞外microRNA(miRNA或miR)富集在外泌体(exosome)中,且受其表面膜的保护而具有很好的稳定性,是理想的分子标志物。目前,多种实体肿瘤均已检测到肿瘤特异性外泌体miRNA(exosomal miRNA)。然而,在AML患者中未见此外泌体miRNA报道。本研究探讨急性髓系白血病血浆外泌体miRNA表达谱差异及新miRNA序列。采用solexa高通量测序技术对7例AML患者(AML组)及7例健康对照者(对照组)血浆外泌体miRNAs进行测序,利用Mireap预测软件进行新miRNAs分析,通过edger差异分析软件筛选组间差异miRNA,获得211个已知的差异表达miRNAs以及2个新miRNAs,选择4个差异表达的miRNAs:miR-155-5p、miR-335-5p、miR-451a及xxx-m0038-5p(新miRNA),在两组(各23例)的血浆外泌体样本中,进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证,验证结果与测序结果一致。对差异表达的外泌体miRNA进行靶基因预测及其GO(Gene Ontology)和信号通路富集分析,发现靶基因聚集的生物学功能多数参与生物进展过程的调控。靶基因主要富集在Fox O、MAPK、Hippo信号通路以及HTLV-I感染等。结果显示,AML患者与健康对照者的血浆外泌体miRNA存在着差异性表达。差异性表达的miRNA特异性很高,对进一步阐明AML白血病发生与发展的分子机制、研发新的无创诊断方法、新的诊断标记物和有效治疗AML的方法具有十分重要和深远的意义。

适用于第2代测序技术的宏基因组DNA提取方法

为快速、高效、大量地获得城市污水处理厂活性污泥中的宏基因组DNA,将3种不同的基因组DNA提取方式进行对比.结果显示,采用液氮研磨+基因组提取试剂盒相结合的方法获得的宏基因组DNA信息量最大,质量好,D(260/280 nm)在1.69～1.72.在进行高通量测序前的样品制备过程中,样品经过初步处理后宏基因组D(260/280 nm)达1.83,满足文库构建要求.利用Solexa Genome Analyzer System测序结果显示,两个样品正向测序结果良好,可用于序列拼接的高质量数据条数占90.8%.

食管鳞状细胞癌患者血清全基因组microRNA测序和分析

目的通过测序、分析食管鳞状细胞癌(ESCC)患者血清全基因组微小核糖核酸(miRNA)表达谱,筛选出表达上调的miRNA,探讨其作为ESCC分子标志物的可能性。方法收集未经治疗的199例ESCC患者血清,同时以107例年龄、性别匹配的健康人血清作对照。用Solexa测序技术对血清miRNA进行测序和表达量测定,用实时荧光定量PCR技术对表达上调的miR-223验证,并与血清CEA含量比较。结果 Solexa测序结果显示,ESCC患者和健康人混合血清小分子RNA中miRNA含量所占比例分别是75.46%和81.44%,22种miRNA在患者血清中表达量是健康人对照的2倍以上;PCR分析证实,miR-223在患者血清中的浓度[M(P25,P75)]显著高于健康人对照[893.8(684.8,1 200.7)fmol/L vs 445.6(347.7,664.0)fmol/L,t=10.03,P<0.01];用于ESCC诊断的miR-223 ROC曲线下面积(AUCROC)为0.84(95%CI,0.79～0.89),明显大于CEA的0.55(95%CI,0.48～0.62),P<0.01;当cut off值为710.2 fmol/L时,miR-223诊断ESCC的敏感性和特异性分别为70%、80%;ESCC患者年龄、性别、病理类型、TNM分期、吸烟史、饮酒史与血清miR-223水平无明显相关性(P>0.05)。结论 ESCC患者血清miRNA表达谱与健康人存在差异,miR-223在患者血清中浓度显著升高,是ESCC潜在的分子标志物。

深度测序鉴定绵羊microRNA转录组

本研究采集的Texel绵羊胎儿的背最长肌样品包括5个发育阶段:70、85、100、120和135 d。通过采用Solexa测序技术对混池样品进行了microRNA(miRNA)深度测序,获得了16532850条原始序列读数。使用ACGT101-miR v4.2分析软件对miRNA测序数据进行了深度发掘;通过与最新的哺乳动物成熟miRNA序列(miRNA数据库:miRBase v17.0)、miRNA前体序列、绵羊基因组序列(绵羊基因组数据库,2010年2月)的比对分析,对绵羊microRNA转录组数据库进行了大幅更新,pre-miRNA(miRNA前体)序列增至1529条,编码的miRNA成熟体序列增至1999条。通过实时荧光定量PCR技术对深度测序获得的5个miRNA在混池样品中进行了验证。绵羊miRNA的研究起步较晚,而miRNA的发现与鉴定将促进基因调控机制及miRNA功能的研究。

高通量测序技术在临床医学中的应用进展

高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表。高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

高通量测序分析系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞microRNAs表达谱差异

目的探讨系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)外周血单个核细胞microRNA(miRNA)表达谱的差异及新miRNA序列。方法采用Solexa高通量测序技术,对SLE组与正常对照组(NC)测序,比较两组外周血单个核细胞差异性表达miRNAs,进行生物信息学分析,并对部分差异表达基因通过Real-time PCR进行验证。结果 SLE组41种新miRNAs显著差异表达,33种上调,8种下调。结论差异表达的新miRNAs在SLE的发生发展过程中起重要的调控作用,可能成为早期诊断SLE的新的生物标志物。

第二代高通量测序技术的原理及其在医学中的应用进展

第二代高通量测序技术近年来取得了较快发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要包括454测序技术、Solexa测序技术以及SOLID测序技术。高通量测序技术在医学领域的研究越来越广泛,本文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

应用Solexa技术检测脐血CD34^+细胞体外诱导的巨核细胞mRNA表达

目的应用Solexa技术研究人脐带血CD34+细胞体外诱导巨核细胞的mRNA表达。方法采用密度梯度离心法和免疫磁珠分选系统获取人脐带血CD34+细胞。100 ng/ml促血小板生成素诱导培养12 d后,应用抗CD41+单克隆抗体免疫磁珠法分选获得巨核细胞和非巨核细胞。应用Solexa技术检测巨核细胞和非巨核细胞的mRNA表达差异。结果获取的Tag初始数量巨核细胞和非巨核细胞分别为3 773 147和3 533 805个。整个清晰的Tag数量分别为3 291 132和2 967 947个,明显独特的tag数量分别为197 769和245 318个。其中上调基因表达数量为1161个,下调为902个。上调Tag表达数量为2717个,下调为1519个。结论巨核细胞和非巨核细胞mRNA表达存在显著差异,差异基因编码产物与细胞发育、黏附、凋亡、代谢、细胞内及细胞间的信号转导以及免疫应答等功能相关,进一步深入将有助于探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制。

高通量测序技术的研究进展

高通量测序技术又称二代测序技术(NGS),与被认为是第一代测序技术的传统Sanger毛细管电泳测序方法相比,二代测序技术以更低的成本提供更高通量的数据,并实现大规模的基因组研究,单次运行数据量大,可以同时对数百万个DNA分子实施测序。随着当代科学技术的进步,二代测序平台已逐渐被引入包括肿瘤学在内的众多领域中,如临床诊断,农业基因组学和法医学等。尽管NGS目前已广泛用于目的性研究,但由于该方法的新颖性,在临床实践中的应用尚未完全指南式化,大多数临床医生对NGS认知及解读能力参差不齐。该文就NGS方法、原理及其优劣性进行综述,旨在帮助临床医生利用NGS技术对疾病进行更全方位的诊疗提供参考。

高通量测序技术对miRNA研究的推动作用

MicroRNA（miRNA）普遍存在于真核生物及病毒中，在动植物的多种生命发生过程中发挥着重要的作用。Solexa高通量测序技术作为一种新的技术手段，现已逐步应用到miRNA的挖掘研究工作中。主要概述了MicroRNA定义及其生物学功能，Solexa高通量测序技术的优点及其在植物MicroRNA研究中的应用。

普通油茶泛素结合酶UBE2-J2的cDNA序列及蛋白质结构分析

泛素结合酶(E2)是泛素/26S蛋白酶体途径中3个关键酶之一,在靶蛋白识别、与泛素连接酶(E3)互作等蛋白的泛素依赖性水解和N-末端规则依赖性水解途径的关键环节中起重要作用。采用Solexa测序技术获得了1条普通油茶E2的全长cDNA序列,命名为UBE2-J2,该基因编码239AA,与其它物种的E2具有较高的一致性和相似性;同源建模的结果表明:普通油茶UBE2-J2蛋白具有泛素结合酶催化位点(UBCc),第8 122位氨基酸碱基为其泛素结合酶基因家族的保守区域,第75 122位氨基酸残基区域中有17个可与泛素形成硫酯键中间产物的残基,其中,87位的半胱氨酸残基是该酶活性中心位点,另有5个残基是与E3酶相互作用的位点。UBE2-J2具有C端延伸结构,故普通油茶UBE2-J2蛋白属于II类E2基因家族成员。

非编码RNA检测技术的研究进展

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)广泛存在于生物体中,不编码蛋白质,以RNA的形式在许多生命过程中发挥着重要的作用。随着越来越多ncRNA生物学功能的揭示,检测ncRNA在不同生理和病理状态下表达谱的变化,已迅速成为研究的热点。为了将ncRNA更好地应用于农业生产和生物医学研究,笔者对ncRNA最新检测技术的原理与应用进行了综述。