急性冠脉综合征患者血清sST2及NLRP3水平与介入术后无复流-慢血流的相关性分析

目的探讨急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,Acs)患者血清可溶性生长刺激表达基因蛋白2(soluble growth stimulation expression gene 2 protein,sST2),核苷酸寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide oligomerization domain like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)水平与经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后无复流-慢血流的关系。方法选择2020年1月~2022年12月佳木斯市中心医院收治的97例急性冠脉综合征患者,所有患者均接受PCI治疗,根据术后无复流-慢血流发生情况分为无复流-慢血流组(n=20)和对照组(n=77)。术前检测血清sST2及NLRP3水平,分析影响急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的因素以及sST2,NLRP3预测急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的价值。结果无复流-慢血流组血清sST2(14.32±2.65 ng/ml vs 11.02±2.13 ng/ml),NLRP3(68.23±10.17 pg/ml vs 42.05±8.23 pg/ml)水平高于对照组,差异具有统计学意义(t=5.860,12.055,均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示高血栓负荷(OR:7.791,95%CI:2.834~21.421)、高水平sST2(OR=2.071,95%CI:1.146~3.743)、高水平NLRP3(OR=2.008,95%CI:1.228~3.284)是急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的危险因素(均P<0.05)。sST2,NLRP3诊断急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的临界值分别为12.91ng/ml,55.39 pg/ml,曲线下面积分别为0.737,0.686,联合sST2,NLRP3诊断急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的曲线下面积为0.907,高于单独诊断(Z=2.662,2.856,均P<0.05)。结论急性冠脉综合征患者血清sST2,NLRP3水平增高与PCI术后无复流-慢血流的发生有关,联合检测sST2和NLRP3可提高对术后无复流-慢血流的诊断效能。

人可溶性TNF受体(sTNFRI)在大肠杆菌中的表达及其活性鉴定

目的 :构建人可溶性TNF受体I(sTNFRI)基因表达载体 ,并在大肠杆菌中高效表达。方法 :用RT PCR扩增编码人TNFRI胞外段基因片段 ,将其插入到表达载体pET 2 8a ,并转入大肠杆菌进行表达。结果 :在IPTG诱导下 ,转入外源基因的大肠杆菌BL 2 1可高效表达sTNFRI蛋白 ,SDS PAGE显示在 2 7kD处有一特异表达条带 ,其表达量占菌体蛋白总量的 31%。纯化的sTNFRI可有效封闭TNF对L92 9细胞的胞毒效应 ;间接免疫荧光显示它可特异性抑制TNF与靶细胞TNFR的结合。结论 :通过基因工程技术获得了人sTNFRI重组蛋白。

人可溶性TNF受体Ⅱ克隆、原核表达与活性鉴定

目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)原核基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达之。方法采用RT-PCR技术,从人外周血的单核细胞中扩增出肿瘤坏死因子受体Ⅱ(TNFRⅡ)基因的胞外区,将其克隆入pET28a(+)高效表达载体进行诱导表达,并对表达产物进行纯化及鉴定。结果在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,转入外源基因的大肠埃希菌BL21(DE3)可高效表达sTNFRⅡ蛋白,SDS-PAGE显示在32kD处有一特异表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的30%左右。纯化的sTNFRⅡ经Western blot鉴定具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示它可有效地封闭分泌性肿瘤坏死因子α(sTNF-α)对L929细胞的胞毒效应;直接免疫荧光显示它可以特异性抑制GFP-sTNF-α与靶细胞肿瘤坏死因子受体的结合。结论通过基因工程技术获得了人sTNFRⅡ的重组蛋白。

sTNFR-IgGFc融合基因在内皮细胞中的表达及其对小鼠关节炎模型的基因治疗研究

可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子的活性,因此已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。本研究将sTNFR与IgGFc片段的融合蛋白基因克隆到真核表达载体pStar上,转染到人的内皮细胞中,获得了表达。表达的sTNFR-IgGFc能够拮抗TNFα对L929细胞的细胞毒活性。将该质粒DNA与脂质体混合,经尾静脉注射到Ⅱ型胶原诱导的关节炎小鼠体内后,应用RT-PCR在鼠的肝脏检测到了sTNFR-IgGFc的表达,并显著地改善了治疗组小鼠关节炎症状和病理反应。这表明抗TNF基因治疗有可能作为治疗类风湿性关节炎的新的途径。

葛兰心宁软胶囊联合常规西药治疗经皮冠状动脉介入术后冠状动脉微血管疾病的临床效果及对血浆相关因子水平的影响

目的观察葛兰心宁软胶囊联合常规西药治疗经皮冠状动脉介入(PCI)术后冠状动脉微血管疾病(CMVD)的临床效果及对血浆可溶性尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(suPAR)和可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)水平的影响。方法选取2021年7月至2022年9月于陕西省人民医院行PCI术后发生CMVD的78例患者纳入研究。完全随机分为观察组(38例)和对照组(40例)。对照组给予常规西药治疗,观察组在对照组的基础上给予葛兰心宁软胶囊口服治疗,2组均连续治疗2个月。比较2组一般资料和临床疗效及治疗前后血浆suPAR和sST2水平变化。结果2组性别、年龄、体重指数、既往史、服药史及常规生化指标水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。观察组总有效率高于对照组[89.5%(34/38)比25.0%(10/40)],差异有统计学意义(P<0.001)。2组各不良反应发生率差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗后,2组suPAR水平均低于治疗前(均P<0.05),sST2水平与治疗前比较差异均无统计学意义(均P>0.05),但sST2在观察组表现出下降的趋势,同时观察组suPAR、sST2水平均低于对照组[(4.4±2.5)μg/L比(5.6±2.6)μg/L、6.12(4.51,10.35)μg/L比9.92(6.33,15.51)μg/L],差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论葛兰心宁软胶囊联合常规西药治疗不仅可以改善PCI术后CMVD患者的心绞痛症状,还可以下调血浆suPAR和sST2水平,且安全性好。推测以上2个因子的下调可能与葛兰心宁软胶囊对CMVD损伤的防护作用有关。

重组质粒PcDNA3.1/sTNFRⅠ在小鼠体内表达的初步研究

目的检测构建的PcDNA3.1/sTNFRⅠ真核表达载体在小鼠体内能否有效表达目的产物,为探索利用该载体基因治疗TNFα介导的炎性疾病奠定一定的实验基础。方法将PcDNA3.1/sTNFRⅠ载体直接注入小鼠胫前肌,ELISA法检测肌肉匀浆中的sTNFRⅠ表达。结果在注射后7d与10d,PcDNA3.1/sTNFRⅠ注射组小鼠肌肉匀浆中sTNFRⅠ表达的量均显著高于PcDNA3.1注射组(P<0.01),注射后第10天sTNFRⅠ表达量高于第7天sTNFRⅠ表达量(P<0.01)。结论采用直接注射法将PcDNA3.1/sTNFRⅠ载体转移入肌肉内可以使目的基因得到一定的表达。

人可溶性sTNFR1及胞膜外区Ig融合基因重组腺病毒的真核表达及功能活性鉴定

目的构建携带人sTNFR1与IgGFc片段融合基因的重组腺病毒,稳定表达并初步鉴定其功能活性在妊娠哮喘炎症机制中的作用。方法将PCR扩增的sTNFR1及IgGFc基因片段先后连接到穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆位点上,酶切线性化后在BJ5183细菌内与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,产生获得的AdE-EGFP-sTNFR1-Ig以脂质体法转染AD293细胞进行病毒包装,以绿色荧光蛋白(GFP)监测病毒滴度及感染效率。RT-PCR、Western blot实验鉴定细胞内重组腺病毒转录及融合基因与蛋白表达;流式细胞术、ELISA实验分析混合培养上清中转染肥大细胞(MC)激活、调节同基因来源T细胞表达Th2/Treg水平及细胞因子分泌效果;MTT评估转染细胞上清中sTNFR1-Ig对TNF-α介导细胞毒效应的拮抗作用。结果成功构建编码sTNFR1-Ig基因的重组腺病毒载体经酶切和测序鉴定正确,制备的腺病毒在转染细胞中的GFP表达以及CPE效应明显,扩增后的滴度为3.7×1010～4.8×1010pfu/ml,体外感染效率可达90%以上;sTNFR1-Ig基因在mRNA及蛋白水平获得的清晰条带均证实腺病毒包装与扩增成功。表达sTNFR1-Ig的MC诱导T细胞转化为CD4+CD25+Foxp3+T细胞水平以及IL-12含量均明显升高,CD4+IL-4+Th2细胞水平下调(P<0.05),Th2/Treg所占CD4+T细胞比值下降(P<0.05)。sTNFR1-Ig封闭TNF-α对MC免疫毒性作用的浓度效应明显,而EGFP-MCs与对照细胞上清对TNF-α毒性效应的中和阻断能力不足(P<0.05)。结论携sTNFR1-Ig基因重组腺病毒参与的免疫调控与妊娠期哮喘发生发展密切相关。sTNFR1及IgG-Fc亚基胞膜外区结合的表达和引起免疫耐受的作用研究,为妊娠哮喘发病机制在理论上的新突破,为以sTNFRI-Ig为靶点的妊娠哮喘干预治疗奠定基础。

通调任督针刺法联合孟鲁司特钠治疗咳嗽变异性哮喘

目的探讨通调任督针刺法联合孟鲁司特钠治疗咳嗽变异性哮喘患者临床疗效及对血清Toll样受体4(TLR4)、嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)、可溶性生长刺激表达基因2(sST-2)影响。方法选择94例咳嗽变异性哮喘患者,随机分为对照组与观察组,各47例。对照组予孟鲁司特钠治疗,观察组在对照组基础上采用通调任督针刺法治疗,2组均连续治疗8周。比较2组临床疗效、肺功能、免疫功能、炎症因子、血清TLR4、Eotaxin、sST-2水平及不良反应发生情况。结果观察组临床疗效总有效率(93.62%,44/47)优于对照组(76.60%,36/47)(P<0.05);治疗后,2组第1秒用力呼气容积(FEV1)、用力肺活量(FVC)、FEV1/FVC均高于治疗前,呼气峰值流量(PEF)变异率低于治疗前,且观察组优于对照组(P<0.05);治疗后,2组CD3^(+)、CD4^(+)水平高于治疗前,CD8^(+)低于治疗前,且观察组优于对照组(P<0.05);治疗后,2组白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)水平低于治疗前,且观察组低于对照组(P<0.05);治疗后,2组TLR4、Eotaxin、sST-2水平低于治疗前,且观察组低于对照组(P<0.05)。结论通调任督针刺法联合孟鲁司特钠治疗咳嗽变异性哮喘,可以显著改善肺功能,提升免疫力,抑制炎症反应,降低血清TLR4、Eotaxin、sST-2水平,值得临床推广应用。

急性冠脉综合征患者血清COMP、sST2及sLRP-1变化及与冠脉病变的相关性分析

目的探讨急性冠脉综合征患者血清软骨寡聚基质蛋白(COMP)、可溶性生长刺激表达基因2(sST2)、可溶性低密度脂蛋白受体相关蛋白1(sLRP-1)变化及与冠状动脉(冠脉)病变的相关性。方法选择2020年1月至2022年1月于青岛市市立医院治疗的120例急性冠脉综合征患者作为病例组,并选择我院同期体检的健康人群100例作为对照组,分析两组COMP、sST2及sLRP-1水平变化及与冠脉病变程度的相关性。结果病例组患者血清COMP、sST2及sLRP-1显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);轻度组(Gensini评分<50分)COMP、sST2及sLRP-1显著低于中度组(Gensini评分50~90分)和重度组(Gensini评分>90分),且中度组血清COMP、sST2及sLRP-1显著低于重度组,差异有统计学意义(P<0.05);预后不良组血清COMP、sST2及sLRP-1较预后良好组更高,差异有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示,血清COMP、sST2及sLRP-1均与冠脉病变程度之间呈正相关(P<0.05)。结论血清COMP、sST2及sLRP-1在急性冠脉综合征患者中均呈高表达,且与冠脉病变程度关系密切,对于控制病情具有重要意义。

小鼠sIL-13Rα2在毕赤酵母菌中的表达及初步活性分析

目的:克隆并在毕赤酵母中表达小鼠sIL-13Rα2基因。方法:从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,应用分段PCR的方法将sIL-13Rα2基因定向克隆至酵母表达质粒pPICZα-A,并转染至毕赤酵母菌表达系统进行目的蛋白表达。目的蛋白行SDS-PAGE和Western分析。结果:克隆出可溶性IL-13Rα2目的基因片段,构建重组pPICZα-A/sIL-13 Rα2表达载体,成功转染至毕氏酵母菌,诱导表达出可溶性IL-13Rα2目的蛋白。结论:已成功克隆并在毕赤酵母中表达了小鼠可溶性IL-13Rα2目的基因,为应用sIL-13Rα2蛋白治疗哮喘及其他过敏性疾病奠定了基础。

hsTR55/TR75-preS1融合蛋白的表达与应用

目的简化测定hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的方法。方法将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)前区(preS1)肽段(2～50)编码区,分别融合于hsTR55和hsTR75基因的C末端组成融合受体分子基因,并利用细小RNA病毒属脑炎心肌炎病毒EMCV的内核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES),构建了hsTR55/hsTR75以及它们与preS1组成的融合受体分子hsTR55hsTR75-preS1基因和新霉素抗性(neoR)基因的双顺反子表达载体,转染BHK-21细胞后用G-418持续筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株。结果RT-PCR及ELISA均证实,两种融合受体分子表达,并且表达上清对hTNFα的活性均具有一定的中和作用。在对表达上清进行ELISA定量后,我们还用Biosensor方法测定了这些可溶性受体分子与hTNFα的结合常数。结果表明,在融合preS1肽段前后,hTNFα与受体分子的解离常数变化不大。结论利用表达的两种融合受体分子,成功地建立了一种检测hTNFα及其突变体的受体竞争结合活性的ELISA法,并利用该法测定了野生型hTNFα及其4种突变体的受体竞争结合活性,所获结果与利用125I-hTNFα测定的结果具有相当的可比性。

肿瘤坏死因子受体2突变载体对巨噬细胞炎症反应的影响

目的探讨肿瘤坏死因子受体超家族1B(TNFRSF1B)196位基因多态性(T突变为G)与巨噬细胞TNF/TNFR2信号通路介导炎症反应的相关性。方法运用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA6.0-TNFR2196Met和pcDNA6.0-TNFR2196Arg,采用脂质体转染法分别转染至巨噬细胞中,转染48 h后使用杀稻瘟菌素抗性筛选4周,建立稳定转染细胞系。将酶消化法培养的巨噬细胞分为四组:空白对照组、pcDNA6.0空质粒组、pcDNA6.0-TNFR2196Met组及pcDNA6.0-TNFR2196Arg组。采用酶切及测序法鉴定重组质粒,RT-PCR检测肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)、cIAP1、cIAP2mRNA的变化;Western blot检测p-JNK、cIAP1、cIAP2、TNFR2及核因子κB(NF-κB)的蛋白表达;ELISA检测细胞上清液可溶性TNFR2(sTNFR2)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平。结果酶切测序结果显示成功构建了TNFR2基因196Met和196Arg表达载体。转染到巨噬细胞后,与空白对照组和pcDNA6.0空质粒组比较,pcDNA6.0-TNFR2196Arg组、pcDNA6.0-TNFR2196Met组TNFR2、cIAP1、cIAP2、IL-1β、IL-6和p-JNK的表达增高(P<0.05);与pcDNA6.0-TNFR2196Met组比较,pcDNA6.0-TNFR2196Arg组TNFR2、cIAP1、cIAP2、IL-1β、IL-6和pJNK的表达明显降低(P<0.05),TNFR2196Arg介导的NF-κB活性显著降低。结论成功构建稳定表达TNFR2196Met、TNFR2196Arg载体,TNFR2突变通过TNF/TNFR2信号通路介导炎症反应,可能是参与慢性炎症性疾病的作用机制。

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因原核表达及活性鉴定

目的:构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的原核表达质粒,诱导sTNFR1-MBP融合蛋白表达,观察表达产物的生物学活性.方法:以HeLa细胞的总RNA为模板.用RT- PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆,经异丙基-β-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1,以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白,并对重组蛋白进行序列分析和Western blot鉴定.MTT法测定重组蛋白的生物学活性的测定.结果:经DNA序列分析和Western blot鉴定,成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌;在IPTG的诱导下,重组质粒菌能表达sTNFR1- MBP融合蛋白,SDS-PAGE显示在66 kDa处有一特异性表达条带;纯化的sTNFR1-MBP融合蛋白经Western blot证实具有生物学活性;生物活性实验(MTT法)显示可有效地封闭TNF-α对OSG7701的细胞毒性作用,随着重组蛋白浓度的增高(0.2,2,20,40,80 mg/L),对TNF-α细胞毒效应的抑制作用增强,细胞死亡率依次为69.98%±1.52%,60.05%±2.18%,46.27%±2.48%,37.02%±3.17%,1.83%±0.59%,1.71%±0.61%.结论:成功获得了具有生物学活性的人sTNFR1-MBP融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.

小鼠IL-13Rα2胞外区基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并在原核表达载体pET-28a中表达小鼠IL-13受体α2(sIL-13Rα2)胞外区基因。方法利用小鼠3T3细胞总RNA,逆转录为cDNA,设计引物,常规PCR法扩增出小鼠sIL-13Rα2基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,经双酶切及测序鉴定后,再亚克隆入pET-28a,构建重组质粒pET-28a/sIL-13Rα2,并转化到大肠杆菌BL21感受态细胞。IPTG诱导表达后表达产物经Western blot鉴定。结果PCR扩增产物与预期大小相符合,重组质粒经双酶切鉴定及基因序列测定表明构建正确;sIL-13Rα2蛋白表达以包涵体形式存在,可与山羊抗小鼠sIL-13Rα2单克隆抗体发生特异性反应,相对分子质量约为36 ku。结论成功原核表达sIL-13Rα2基因,为进一步探讨sIL-13Rα2在血吸虫病肝纤维化过程中的调节作用奠定了基础。

人可溶性血管内皮细胞生长因子受体Flt-1基因在链霉菌中的克隆表达

应用RT PCR技术 ,从人脐静脉内皮细胞中扩增出编码人可溶性血管内皮细胞生长因子 (VEGF)受体Flt 1胞外区前四个结构域的基因片段 ,亚克隆至pUCl8质粒进行测序 ,将目的基因片段连接至链霉菌表达载体pSGLgpp ,获得重组质粒pSGLgpp F ,将其转化至Streptomy ceslividansTK2 4 ,获得基因工程菌株Sreptomyceslividans (pSGLgpp F) ,对其培养上清液进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,结果显示 ,在 6 3 6kD处有特异性条带出现 ,表明sFLT 1在链霉菌中获得了成功表达 ,受体配基结合实验显示表达产物与VEGF可特异性结合 。

人可溶性白细胞介素- 6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素- 6受体（ sIL- 6R）基因。方法将人 sIL- 6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体 pAcGP67B中，再将重组转移载体质粒与野生病毒 AcNPV DNA共转染昆虫细胞 Sf9；经同源重组后，以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒；采用空斑分析法纯化重组的病毒，然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞 Sf9。结果斑点杂交实验证实，纯化得到的重组病毒含有人 sIL- 6R基因； SDS- PAGE结果显示，表达产物 sIL- 6R相对分子质量为 47 000左右； Western blot和受体配基结合实验表明，表达产物具有与其配基特异性地结合的能力。结论杆状病毒－昆虫细胞系统能分泌表达 sIL- 6R，表达产物具有免疫活性和生物活性。

循环可溶性生长刺激表达基因2蛋白水平与白细胞介素1受体样分子1基因多态性的相关性分析

目的探讨循环可溶性生长刺激表达基因2蛋白(s ST2)与白细胞介素1受体样分子1(IL1RL1)基因多态性的关系。方法利用国际千人基因组项目筛选出完整的IL1RL1基因和标签单核苷酸多态性(SNP),然后提取2016年10月至2017年4月于首都医科大学附属北京安贞医院进行体检的350例受试者的全基因组DNA,聚合酶链反应扩增后,采用MALDI-TOF质谱仪分析,检测结果使用TYPER 4.0软件获取原始数据及基因分型图。分析s ST2水平与IL1RL1基因标签SNP的相关性。结果所有受试者s ST2水平为6.45(4.58,9.38)μg/L。IL1RL1基因共筛选出5个标签SNP,分别为rs12712135、rs1921622、rs11123923、rs3821204、rs4988958,均与s ST2水平相关(均P<0.05),其中rs12712135位点与s ST2水平相关性最显著。调整年龄、性别、体重指数、吸烟、基础疾病后,5个SNP仍与高s ST2水平(≥6.45μg/L)风险独立相关(均P<0.05)。结论循环s ST2水平受IL1RL1基因遗传变异的影响。

MODULATION OF MACROPHAGE-MEDIATED CYTOTOXIC ACTIVITY——EFFECT OF FUSARIN C ON Mφ-CF PRODUCTION AND TNF-α mRNA EXPRESSION

Fusarium moniliforme is a predominant fungus found in fungus-contaminated food in Linxian County, China, a high risk area of esophageal. cancer. Rats fed with corn bread inoculated with Fusarium moniliforme developed papillomas and squamous-cell carcinomas

可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测

本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。

豨莶草水洗脱部位对人肺纤维细胞的毒性与药效作用

目的:检测不同浓度豨莶草水洗脱部位(SWEF)对MRC-5人肺纤维细胞的毒性作用及对MRC-5细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达与炎症因子的影响,从而发现豨莶草毒效与药效作用物质基础。方法:以MRC-5细胞为研究对象,采用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法结合流式细胞术、台盼蓝染色判定SWEF(1,6,10,20,50 g·L^(-1))对MRC-5细胞的毒效作用;通过测定沉默基因前后α7nAChR的表达及炎症因子水平的变化探讨SWEF对MRC-5细胞的药效作用。结果:SWEF(≥6 g·L^(-1))显著降低MRC-5细胞的存活率(P<0.01),促进MRC-5细胞凋亡与坏死(P<0.01),其半数抑制浓度(IC50)为6.03 g·L^(-1);MRC-5细胞α7nAChR表达与炎症因子检测显示SWEF含有α7nAChR激动剂样物质,该物质可增高α7nAChR基因和蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),降低炎症因子水平(P<0.05,P<0.01),SWEF下调炎症因子的作用可能与其上调α7nAChR mRNA表达有关,二者呈负相关(P<0.01)。结论:SWEF(≥6 g·L^(-1))对MRC-5细胞具有显著的毒性作用,药效作用研究证实SWEF含有α7nAChR激动剂样物质,该物质可增高α7nAChR的表达,降低炎症因子水平,推测过量的α7nAChR激动剂样物质可能为豨莶草的毒性成分之一。