山梨糖脱氢酶基因在大肠杆菌染色体上整合及表达

以质粒pKF3为模板 ,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源 ,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段 ,连至pMD18 T载体 ,构建得到pMD18 PC。以质粒pQE6 0 SDH为模板 ,扩增山梨糖脱氢酶基因sdh ,与pMD18 PC连接 ,得到pMD18 PC SDH。将其用PvuⅡ酶切 ,回收含ptsG1 cat sdh ptsG2 的目的片段 ,电转化至JM10 9 pKD4 6 ,在Red重组酶的作用下 ,外源DNA片段与染色体上对应区域发生同源重组 ,将基因ptsG敲除 ,替换为cat sdh基因 ,获得整合sdh基因的JM10 9s。经检测JM10 9s具有山梨糖脱氢酶活性。以ptsG基因上下游序列为引物 ,JM10 9s基因组DNA为模板进行PCR 。