7种细菌性虫媒病病原体的反向线状印迹杂交检测技术的建立

【目的】建立快速高效的细菌性虫媒病的检测方法。【方法】运用反向线状印迹杂交技术(reverse line blot,RLB),通过对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)7种细菌的核糖体16S RNA进行序列比对,利用DNAStar和Primer premier软件设计出了用于PCR-RLB杂交反应的基因组DNA样品进行PCR扩增的通用引物(RLB-F,RLB-R),和特异性探针以及通用探针(Catch-all),通用下游引物(RLB-R)5'端用生物素标记和探针5'端连接氨基团(NH_(2)^(+))。【结果】成功建立高效、快速、特异且能同时检测7种细菌PCR-RLB的方法,并确定了通用引物最佳浓度为25μmol/L,金黄色葡萄球菌和福氏志贺菌探针的最佳浓度分别为50μmol/L,其他5种病原探针的最佳浓度为100μmol/L。使用PCR-RLB检测方法,可对上述7种细菌的检测敏感性可达到10^(-6)~10^(-11) ng/μL,远远高于PCR的10^(-3)~10^(-8) ng/μL。【结论】首次同时对7种细菌进行检测,并确定了不同引物及探针的最佳浓度。该方法不仅提高了检测效率,同时还提高了检测的灵敏度,为开发新的检测手段提供了理论依据。

Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介

Southern印迹杂交（Southern blot）是分子生物学领域中最常用的技术方法之一，该技术是1975年英国爱丁堡大学的E．M．Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。后来相继出现了三个原理、过程相似，但是操作对象不同的印迹方法，缘于学界前辈的幽默分别将其称为Northern blot、Western blot和Eastern blot，这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。本文简要介绍了Southern印迹杂交及其相关生物技术。

一种快速筛选阳性克隆的方法——反向Northern印迹杂交技术

本实验采用反向Northern印迹杂交 (reverseNorthernblot)技术 ,对经反转录差异显示PCR(differentialdisplayre versetranscriptionalPCR ,DDRT PCR)获得的 5 6个差异片段 (cDNA)进行阳性片段的初步筛选 ,获得 8个候选阳性片段 ,经Northern印迹杂交实验 ,确证 5个阳性片段。实验表明该方法是一种快速检测和筛选阳性克隆片段的方法 ,并具有简便、经济的优点。它不仅可用于各种分离差异片段的方法中差异片段的初步筛选 。

蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad2/3蛋白表达的影响

目的:观察采用蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法探讨葛根素通过TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3对于促进成骨细胞增殖分化机制的研究。方法:原代培养新生小鼠成骨细胞,分别用空白对照组(含10%DMEM)及3种不同浓度分别为1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL的葛根素干预液处理成骨细胞。采用MTT实验法检测葛根素对成骨细胞生长的影响,Western Bloting法检测葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3表达的影响。结果:不同浓度的葛根素有促进成骨细胞生长的作用,并可以提高TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3的表达,呈浓度依赖性,分别与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05)。结论:葛根素可以通过TGF-β1及Smad 2/3信号转导途径促进成骨细胞增殖与分化。

非同位素PCR及Southern印迹杂交分析检测脆性X综合征FMR-1基因突变

目的 建立一种非同位素的检测脆性X综合征智力缺陷基因(FMR - 1)突变的方法。方法 采用PCR技术结合Southern印迹杂交技术对FMR - 1基因进行分析,进而确定其突变类型。结果 共对190例样本进行了检测,其中2例为女性前突变携带者,1例为女性全突变患者。结论 非同位素PCR方法可以简便、安全、可靠地检测FMR - 1基因中(CGG)n重复拷贝数,可作为临床上对脆性X综合征的筛查的首选方法;而非同位素Southern印迹杂交可对结果不确定者进一步进行检测。

化学发光技术在Southern印迹杂交中的应用

目的:探讨化学发光技术(CSPD)在Southern印迹杂交中的应用情况。方法:随机引物法地高辛标记模板,化学发光法直接检测探针标记效率,进行模拟杂交确定最适探针浓度、检测探针敏感性。结果:化学发光法直接检测探针标记效率为0.1 pg,模拟杂交中化学发光法检测探针敏感性达到0.03 pg,最适探针浓度为40 ng/ml。结论:化学发光技术检测敏感性高,可用于基因组Southern印迹杂交检测单拷贝基因。

皮肤组织印迹杂交法诊断犬利什曼病研究初报

用利什曼病原虫KDNA印迹杂交法对采自甘肃省文县黑热病流行区的30只家犬耳缘皮肤组织印迹样品进行杂交试验。结果30份犬样品中有8份呈现阳性反应,阳性率为26.7％。同时进行骨髓涂片检查,有5只犬查见原虫,阳性率为16.7％。以上两种方法的符合率达76.7％(23/30)。印迹杂交法具有特异性高,取材方便,快速和结果易于观察等优点,在诊断犬利什曼病中有一定应用前途。

柔嫩艾美耳球虫端粒DNA重复序列的South-ern印迹杂交分析

为进一步确定柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)端粒DNA的重复序列,为下一步端粒酶活性检测奠定基础,根据已克隆发表的E.tenella端粒DNA重复序列信息,设计了由4个端粒重复序列串联的寡聚核苷酸探针(TTTAGGG)4,并以生物素地高辛标记。将该探针与经BAL31-EcoRⅠ酶切后的E.tenella基因组DNA进行Southern印迹杂交分析。结果显示:E.tenella基因组DNA与探针杂交获得了清晰的杂交条带,随BAL31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,进一步证明了E.tenella端粒DNA重复序列为5-′TTTAGGG-3′,且此重复序列在E.tenella染色体的末端。

应用Southern印迹杂交法检测转移基因在宿主细胞中的整合

目的 应用Southern印迹杂交法 (Southernblot)证实转移基因整合至宿主细胞基因组DNA。方法 酚氯仿法提取基因转导的PA317/AIM及K5 6 2 /AIM细胞基因组DNA ,以聚合酶链反应 (PCR)扩增转移基因片段 ;随机引物法标记3 2 P -DNA探针 ,与经BamHI酶切、琼脂糖凝胶电泳、转移至尼龙膜的基因组DNA进行Southern杂交反应 ,检测转移基因的整合。结果 PCR反应和Southernblot分析证实转移基因存在于受体细胞基因组DNA中。结论 Southern印迹杂交法证实转移基因稳定整合至逆转录病毒生产细胞PA317/AIM及靶细胞K5 6 2 /AIM中。

免疫印迹杂交在院内肺炎感染途径中的应用

目的 为确证胃→咽→下呼吸道逆行感染途径存在与否 ,研究胃液pH值变化与院内感染性肺炎 (Nosoco mialPneumonia ,NP)发生的关系。方法 以气管切开 (或插管 )病人为研究对象 ,用防污染标本刷 (PSB)采集标本 ,由细菌表型分型 ,直至质粒DNA、酶切、Southern -blot印迹杂交等基因分型 ,前瞻性观察NP的发生情况。结果 11名患者有逆行感染存在 (发生率为 2 2 % ) ,即在胃部分离出病原菌 1、2天后 ,PSB在咽部及下呼吸道也检出相同的细菌 ,应用质粒图谱、酶切图谱和Southern blot印迹杂交等分子生物学技术进行同源性分析 ,证明其有很高的同源性。将美蓝经胃管注入病人胃内 ,1、2天后在咽部及下呼吸道可检出蓝色分泌物。随着胃液pH值升高 ,胃内细菌定植增加 ,NP的发生率升高。结论 存在胃→咽→下呼吸道逆行感染途径。NP的发生与胃液pH值显著相关。

用PCR扩增及Southern印迹杂交对新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病病原体kDNA同源性研究

本研究自新疆克拉玛依地区皮肤利什曼病（ＣＬ）患者的皮肤病变组织内抽取微量的利什曼原虫ｋＤＮＡ，采用引物１３Ａ、１３Ｂ进行ＰＣＲ扩增，获１２０ｈＰ扩增产物（ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ），并转移到尼龙膜上，分别与地高辛（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ）标记的Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｇｅｒｂｉｌｌｉ、Ｌ．ｍａｊｏｒｋＤＮＡ探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果可见病变组织内ｋＤＮＡＰＣＲ－ＡＰ仅与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ探针有明显的杂交信号带，提示该地区皮肤利什曼病病原体ｋＤＮＡ与Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ有较强的同源性。为进一步分析该病原体与Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ和Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株的同源关系，我们采用杜氏利什曼原虫（Ｌ．ｄ）种特异引物Ⅰ和Ⅱ对患者病变组织进行ＰＣＲ扩增，未见扩增产物。用地高辛标记的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ探针对Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆各分离株进行打点杂交，结果显示该地区ＣＬ病原体与Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ新疆分离株以及其它利什曼原虫呈阴性反应。以上结果证实Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａｋＤＮＡ与克拉玛依地区ＣＬ患者的ＣＬ－ＰＣＲ－ＡＰ之间的同源关系。

核酸点印迹杂交法检测枣疯病植原体

该文详细介绍了应用核酸点印迹杂交法 (Dot- blot)检测枣疯病病原植原体(Phytoplasma)的操作步骤和检测结果 ,分析和讨论了检测结果和检测中可能出现的问题 ,认为此法是鉴定枣疯病病原植原体的准确、灵敏的方法 。

犬贾第虫端粒重复序列的Southern印迹杂交分析

目的确定犬贾第虫端粒DNA的重复序列,为进行端粒酶活性检测奠定基础。方法根据已发表的蓝氏贾第虫的端粒重复序列5′-TAGGG-3′设计寡聚核苷酸探针(TAGGG)5,并以地高辛标记,将犬贾第虫基因组DNA经Bal31-EcoRⅠ酶切后,进行Southern印迹杂交分析。结果犬贾第虫基因组DNA与探针(TAGGG)5杂交,获得了较好的杂交条带,随Bal31酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱。结论犬贾第虫端粒重复序列定位在染色体的末端序列与国外报道的贾第虫端粒重复序列一致,为5′-TAGGG-3′。

South western印迹杂交

Soathwestern印迹杂交(Southwestern Blot)主要用于调控蛋白(Transacting Factors)与DNA调控元件(Cisacting Elements)相互作用的研究,是根据位点特异性DNA结合蛋白借助于氢键、离子键和疏水键与同位素标记的特异DNA序列探针结合,通过放射自显影体系对DNA结合蛋白进行定性。

狭缝印迹杂交分析癌转移抑制基因nm23在人肺癌中的表达

为探讨癌转移抑制基因（ｎｍ２３）在人肺癌发生、发展中的作用，采用狭缝印迹杂交技术检测了不同部位、不同性质人肺组织中的ｎｍ２３－Ｈ１和ｎｍ２３－Ｈ２基因的ｍＲＮＡ表达。结果发现，ｎｍ２３－Ｈ１和ｎｍ２３－Ｈ２基因的ｍＲＮＡ表达，都有从正常肺组织、肺良性病变组织、非癌肺组织及癌旁组织、癌灶组织、到癌转移淋巴结组织逐渐降低的趋势。其中，肺癌组织较正常肺组织的ｎｍ２３－Ｈ２基因ｍＲＮＡ表达显著降低（Ｐ＜０．０５），癌转移淋巴结组织较正常肺组织的ｎｍ２３－Ｈ１和ｎｍ２３－Ｈ２ｍＲＮＡ表达均显著降低（Ｐ＜０．０５）。肺癌组织的ｎｍ２３基因表达与淋巴结有无癌转移无明显相关关系（Ｐ＞０．０５）。提示ｎｍ２３基因表达降低可能与肺癌发生有关，未发现ｎｍ２３有癌转移抑制作用。

基因重组乳链球菌防龋疫苗的研究 Ⅲ．乳链球菌重组质粒DNA的Southern印迹和点印迹杂交分析

为了证实重组质粒ＤＮＡ分子中插入的外源ＤＮＡ确是来自变形链球菌拱体菌，检测受体菌中是否有探针同源的序列。本研究采用ＤＮＡＳｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点印迹杂交和切口平移制备生物素ＤＮＡ探针以及光敏基因检测技术，对乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７中的重组质粒ＤＮＡｐＬＦ１０２，ｐＬＦ１０７作了进一步分析鉴定，ＤＮＡ点印迹杂交结果显示，含有ｐａｃ基因的ｐＰＣ４１ＰｓｔⅠ酶切ＤＮＡ探针均与上述质粒ＤＮＡ结合，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交提示重组质粒１．５ｋｂ的酶切片段与生物素探针杂交，证实该基因片段是从ｐＰＣ４１中获得的变形链球菌目的基因片段，重组乳链球菌ＨＬ１０２，ＨＬ１０７均携带变形链球菌表面蛋白抗原（ＰＡｃ）结构基因ｐａｃ。

特异性蛋白质印迹杂交检测人和猪的旋毛虫感染

旋毛虫病是人畜共患病，是由旋毛虫属寄生虫引起的，该病在全世界广泛分布。为了确诊，需用蛋白质印迹杂交检测验证人和猪血清样品EUSA检测阳性样品，因为ELISA检测结果有许多假阳性。这个研究的目的是鉴定在感染人和猪的血清中大量存在的旋毛虫特异抗原，界定一个检测旋毛虫的特异方法[通过蛋白质印迹杂交（westernblots）检测方法检测感染宿主血清]，可以将假阳性血清与真阳性血清分开。

琼脂糖凝胶直接杂交法

DNA印迹(Southern blot)杂交法是研究DNA分子结构,变异及其组成的一种分子生物学技术。自1975年闻世以来,在分子生物学,遗传学及分子病毒学等研究领域得到广泛应用,对这些学科的发展起了重要作用。由于该技术均需要首先将电泳后已变性的DNA从琼脂糖凝胶转移至支持膜上,因此,实验结果的好坏很大程度取决于吸印的效果。

非同位素标记探针杂交分析白细胞端粒DNA长度

目的建立用非同位素标记探针杂交测定端粒DNA长度的方法,并探讨其法医学的应用价值。方法酚/氯仿抽提基因组DNA,限制性内切酶消化,0.8％琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹,化学发光法检测端粒DNA谱带,与标准分子量DNA比较,积分光密度扫描计算端粒DNA平均长度。结果所测样本获得了较好的低背景杂交谱带,测得31~35岁端粒。DNA的平均长度为11.71kb,51~55岁平均为11.04 kb。结论用上述建立的方法初步显示年龄与端粒长度之间有一定的相关性,为法医学年龄的推断开辟了一个新的研究领域。