黄瓜抗病基因类似序列(RGA)的同源性分析和Southern鉴定

使用ClustalW和DNAMAN3.0分析了本实验室克隆的15个黄瓜抗病基因类似序列(RGA)之间以及与烟草的N基因、亚麻的L6基因和拟南芥的RPS2基因之间的同源性,并对这些RGA进行了PCR和Southern验证与分析。结果表明:15个黄瓜RGA中,核苷酸序列同源性最高的是CsRGA2、CsR-GA4和CsRGA5,其次是CsRGA6、CsRGA7、CsRGA8和CsRGA9,CsRGA1和CsRGA3也存在较高的同源性;其余的RGA同源性较低。在氨基酸序列上也表现了相同的特征。与N、L6和RPS2等抗病基因的产物之间同源性最高46%,最低22%。根据核苷酸序列设计了15对特异引物,用PCR方法验证了所有黄瓜RGA的存在,其中CsRGA3在黄瓜品种间表现出多态性。利用特异引物PCR方法合成了15个黄瓜RGA的地高辛探针,与EcoRⅤ酶解的黄瓜‘215’、‘129’和‘L18’的基因组DNA进行Southern杂交,证实了各个RGA在基因组上的存在,同时发现,CsRGA9、CsRGA11～CsRGA15都是多拷贝,CsRGA3是单拷贝,其余为双拷贝。

多重实时PCR对宫颈癌组织及SiHa细胞株HPV-16病毒存在状态的检测

背景与目的:人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染与宫颈癌发生发展密切相关,高危型HPV病毒整合入宿主细胞是细胞转化及癌变的关键。病毒整合状态的检测对深入探讨宫颈癌发生发展机制及预测宫颈病变的转归有一定的临床意义。然而目前尚没有一种理想的能够用于各种临床标本的HPV存在状态的检测方法。本研究旨在探讨HPV-16存在状态的理想检测方法。方法:以HPV-16质粒为标准品,利用两种不同的荧光报告基团,采用多重实时PCR同管定量检测HPV-16E2和E6基因,根据E2和E6基因拷贝数的比值(E2/E6)来判定HPV-16的存在状态;对HPV-16阳性的宫颈癌SiHa细胞和27例宫颈鳞癌新鲜标本进行多重实时PCR与Southern杂交检测,将两种检测方法的结果进行比较。结果:(1)多重实时PCR所得到的HPV-16E2、E6标准曲线相关性好,相关系数均为1.00,扩增效率均在95%以上。(2)对系列稀释的HPV-16质粒进行重复检测,确定了E2/E6比值为1时该多重实时PCR检测系统的95%参考值范围为0.81～1.29,以0.81作为区分游离型和混合型HPV-16的界值。(3)多重实时PCR与Southern杂交检测均发现SiHa细胞中HPV-16呈整合型,27例鳞癌中22例获得了一致的检测结果,符合率为81.5%,Kappa值为0.844,P<0.001。结论:多重实时定量PCR是一种可靠的、便于临床应用的检测HPV-16病毒存在状态的方法,具有省时、简便快速、高通量的优点,并且能用于石蜡切片以及病灶较小、DNA含量少的宫颈癌前病变组织或宫颈细胞学标本。

ERIC-PCR鉴别苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌的研究

利用ERIC-PCR技术对苏云金芽孢杆菌(Bt)、蜡状芽孢杆菌(Bc)和对照菌基因组DNA进行扩增,回收、标记BtPCR扩增片段,分别与各菌株的基因组DNA进行斑点杂交和Southern杂交,筛选Bt标识序列。结果显示:Bt各菌株均可扩增得到250bp的特异片段;Bt和Bc均可得到600bp的共有扩增片段;以筛选得到的569bp片段为探针,可特异性地与Bt基因组DNA杂交;ERIC-PCR技术可以在DNA指纹图谱水平区分鉴别Bt与Bc菌,正确反映出两者的亲缘关系。结果表明ERIC-PCR技术在Bt的检测及在Bt与Bc的鉴定中具有较强的实用性。

外周血甲胎蛋白mRNA和白蛋白mRNA在评估肝癌微小转移中的比较研究

目的 探讨肝病患者外周血甲胎蛋白mRNA(AFPmRNA)和白蛋白mRNA(ALBmRNA) ,作为肝癌微小转移标志物的特异性。方法 提取患者和健康志愿者的外周血单个核细胞总RNA ,进行RT PCR ,扩增产物再进行Southern杂交。结果 原发性肝癌 (HCC)组外周血AFPmRNA的检出率为 4 1.4 % ,对照组为 0 % ,差异显著 (P <0 .0 5 ) ;HCC组外周血ALBmRNA的检出率为4 4 .8% ,对照组为 2 9.2 % ,二者差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 作为肝癌微小转移的标志物 。

玉米基因枪转化Bt基因的研究

以玉米自交系A188为试材,将含有Bar基因和Bt基因的质粒pBW3导入玉米幼胚内,获得了转基因抗性苗。抗性植株点杂交及Southern杂交结果显示,该基因已整合到抗性玉米植株体内,外源基因在玉米基因组内有4个拷贝。

重组质粒pcDNKCpG在动物体内分布、残留及水平传播检测

通过肌肉注射的途径将重组质粒pcDNKCpG导入到鸡和猪体内，提取不同时间段的动物组织DNA，特异性的PCR扩增结果提示重组质粒pcDNKCpG主要分布在鸡和猪的血液和注射部位肌肉中，残留时间分别不超过16天和8天；凝胶电泳回收的组织DNA经过酶切、电泳和转膜后的Southem检测表明，重组质粒pcDNKCpG没有整合到鸡和猪的任何组织DNA中去；地高辛标记的CpG核酸探针的Southem检测结果显示重组质粒pcDNKCpG没有整合入宿主的基因组中；特异性的PCR扩增结果证实重组质粒pcDNKCpG没有转移到其他的环境微生物中去。因此，重组质粒pcDNKCpG具有良好的生物安全性。

水牛SRY基因的克隆及序列分析

根据荷斯坦牛SRY基因设计一对引物,采用聚合酶链式反应(PCR)技术,以中国沼泽型水牛(Swamp Buffalo)基因组DNA为模板,扩增得到SRY(Sex deterimation region of Y chromosome)全序列约2005bp,其中1-504bp为5’启动子区,1196-2005bp为3’侧翼序列,在505-1195bp为SRY的外显子,编码229个氨基酸。在SRY HMG-box区域设计探针,用地高辛标记后分别与雄性、雌性水牛基因组DNA进行Southern杂交,结果显示该段序列只在雄性DNA样本中有杂交信号,证明SRY基因为雄性特异。BLAST比对结果显示与牛属动物SRY基因的同源性为96％,其中SRY基因HMG box区域同源性高达99％,说明SRY基因具有高度的进化保守性。

人乳头瘤病毒核酸检测技术进展及其应用

当今,随着分子学生物技术的不断发展,人们用于人乳头瘤病毒检测的手段也越来越多,其中核酸检测主要包括第2代杂交捕获、聚合酶链反应、原位杂交、Southern杂交和斑点杂交等方法.临床应用的有第2代杂交捕获和荧光定量聚合酶链反应.第2代杂交捕获法为一种半定量方法,是目前美国食品与药物管理局唯一批准能够在临床使用的人乳头瘤病毒DNA检测技术.该法具检测效能高,并可对人乳头瘤病毒进行高危型和低危型分析,为临床人乳头瘤病毒(特别是高危型人乳头瘤病毒)感染的早期诊断和监测提供了新的手段.

2株霍乱毒素（CT）阴性霍乱弧菌的分子生物学检验

近年来，分子生物学技术越来越多地应用到霍乱弧菌的研究中，用于从分子水平上区分菌株的类型，研究菌株的变异以及菌株之间的关系，追踪传染源，进行快速鉴定和监测等方面。本文采用分子杂交方法，对两株不同来源的霍乱弧菌进行了研究，用ctxA基因探针分别进行原位杂交和Southem杂交，确定为CT基因阴性株；采用16s rRNA基因探针检测限制性图谱(GRP)，

羊驼核糖体蛋白S5(RPS5)基因与绒毛生长发育的研究

利用southern blotting技术从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出核糖体蛋白S5(RPS5)基因,对该基因进行测序,通过对羊驼RPS5基因的序列结构特点及编码氨基酸与其它哺乳动物的进行比较分析,从而发现羊驼RPS5基因的特性;并对序列进行生物信息学分析,确定基因发挥功能的特殊结构域,进而对羊驼RPS5基因的功能进行分析研究,为以后的相关研究奠定基础。

动态突变的研究进展

本文就一种新的突变方式——动态突变的类型和分子生物学检测方法等的研究进展作一综述,旨在进一步研究某些遗传病症提供理论依据。

应用RT-PCR并Southern杂交技术检测乳腺癌骨髓微转移

目的 检测原发性乳腺癌骨髓微转移的发生及与其它临床参考指标的关系。方法 应用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)并Southern杂交技术 ,检测骨髓单个核细胞中细胞角蛋白 19(CK - 19)基因表达。结果 5 2例骨髓标本共检出微转移 19例 ( 3 6.5 % ) ,其中 17例淋巴结有转移者 ,9例CK - 19表达阳性 ( 5 2 .9% ) ;而无淋巴结转移的 3 5例中 ,10例CK - 19表达阳性 ( 2 8.6% )。微转移检出率与肿瘤大小有关 (P <0 .0 5 )。结论 以CK -19为标志物 ,RT -PCR并Southern杂交方法检测原发性乳腺癌骨髓微转移灵敏、特异 ,可做为临床判断预后的参考指标。

肝癌患者手术后外周血AFP mRNA的检测及其与术后复发的关系

目的探讨肝癌患者手术后外周血AFP mRNA的检测及其与术后复发的关系。方法原发性肝癌手术治疗患者29例，对照组为15例非原发性肝癌但须行肝部分切除手术者。分离术后第1，7和14天外周血单个核细胞，提取单个核细胞的总RNA，进行RT—PCR和Southem杂交，检测AFP mRNA，并对肝癌患者进行36个月的随访。结果全组有18例原发性肝癌患者复发。术后3次检测外周血AFP mRNA不全阴性者17例，其中14例复发，复发率为82．4％；3次检测均为阴性者12例，有4例复发，复发率为33．3％，差异有统计学意义（P＜0．05）。对照组手术后外周血AFP mRNA检测均为阴性。结论原发性肝癌患者手术后外周血AFP mRNA的检测可以预测肝癌的复发情况。