四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应 (PCR) ,Southern杂交和 RT-PCR检测。结果 PCR和 Southern杂交检测结果表明 ,外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中 ,RT-PCR结果表明其 DNA可以正常转录成 m RNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。

农杆菌介导南瓜遗传转化体系的建立

以南瓜金辉一号(Cucurbita moschata' Jinhui1')为实验材料,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化南瓜子叶节,研究了预培养时间、侵染时间、乙酰丁香酮(AS)浓度和共培养时间,抗生素羧苄青霉素(Carb)、头孢霉素(Cef)以及筛选剂卡那霉素(Kan)等因素对离体不定芽的影响,建立了南瓜最适遗传转化体系。结果表明:外植体预培养0天,侵染时间30分钟,AS浓度为100mg·L-1,共培养5天可获得最高遗传转化效率;最适除菌剂为Cef,其最适浓度为500mg·L-1;最适Kan筛选浓度为100mg·L-1;在MS培养基上培养抗性芽生根,经PCR和Southern blot检测,证明为转基因植株。

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

【目的】筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据。【方法】采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA1301为基本载体,构建抑制大豆RACKl基因表达的RNAi载体。通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测。【结果】克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIAl301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确。通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中。经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%。【结论】成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础。

病毒RNA复制酶—Nib基因转化番木瓜的研究

通过胚状体振动共培养法将农杆菌ＬＢＡ４４０４介导的复制酶基因转入番木瓜，经过含有卡那霉素１００μｇ／ｍＬ的培养基筛选培养，获得了转化植株，ＮＰＴⅡ分析和ｈｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交结果表明，复制酶基因Ｎｉｂ片段已整合到番木瓜的核基因组中。

大鼠自发性高血压和心肌肥厚时热休克蛋白70基因表达的研究

本工作采用热休克蛋白７０（ＨＳＰ７０）核酸分子杂交方法，检测了自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）与其正常对照（ＷＫＹ）大鼠离体培养的主动脉平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）受热刺激后以及大鼠腹主动脉缩窄后心肌肥厚时左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的水平，并对ＳＨＲ和ＷＫＹ肝组织基因组ＤＮＡ进行了限制性酶切片断长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果表明：ａ．３７℃培养的ＳＨＲＡＳＭＣ及整体ＳＨＲ肝组织ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ的基础表达水平均低于ＷＫＹ大鼠，ＳＨＲＡＳＭＣ受热刺激（４２℃１５ｍｉｎ）后２ｈ，ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达增加的程度明显大于ＷＫＹ大鼠。ｂ．大鼠腹主动脉缩后造成左室压力超负荷，左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ在压力超负荷４ｈ时已明显升高，１ｄ、２ｄ、１ｗ均维持在高水平，１ｗ后逐渐降低。ｃ．ＳＨＲ和ＷＫＹ鼠肝组织基因组ＤＮＡ经ＢａｍＨＩ酶切后，ＳＨＲＨＳＰ７０基因缺失一条约５．６ｋｂ的片段。提示：ＳＨＲＡＳＭＣ对热敏感性增加；压力负荷增加早期，左心室ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ表达明显增加；ＨＳＰ７０基因结构异常可能与高血压发生有关。

用地高辛标记原位杂交技术定位黄鳝rRNA基因于二价染色体3q12─q24和7q14─q26

以地高辛标记重组质粒ＰＴＡ７１中所含的小麦ｒＲＮＡ基因作为探针，与ＥｃｏＲＩ酶切的黄鳝核基因组总ＤＮＡ经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，呈现２条带，片段长度分别为１２．８ｋｂ和４．６ｋｂ。再运用染色体原位杂交技术及杂交后多重带显带技术，定位ｒＲＮＡ基因于黄鳝二价染色体３ｑ１２－ｑ２４和７ｑ１４－ｑ２６两个区间，其分布位点与硝酸银染色法结果相符。此外，还讨论了在黄鳝二价体上开展基因定位研究的突出优点。

露水草毛状根的诱导和培养

发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇ６ｎｅｓ）ｐＲｉ１５８３４菌株感染露水草（Ｃｙａｎｏｔｉｓａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ）的茎和根的外植体及小苗，均诱导出毛状根。毛状很能在不含激素的ＭＳ培养基上生长。用纸电泳和高效薄层层析法，在毛状根中检测到甘露碱。用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，在植物ＤＮＡ中检测到ｒｏｌｅ基因。表明Ｒｉ质粒的Ｔ—ＤＮＡ部分已转移到毛状根细胞的ＤＮＡ中。该毛状根能产生β－蜕皮激素。露水草毛状根的诱导培养在单子叶植物中是一个成功的先例。

转基因小鼠乳腺表达重组人溶菌酶

人溶菌酶是由130个氨基酸组成的碱性多肽,具有抗菌、抗病毒和增强免疫力的功能,对生物体的自身防御起着重要作用.为研究乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶和提高牛奶的免疫活性,制备了以溶菌酶基因组序列为目标基因的表达载体的转基因小鼠模型.经转基因小鼠的制备,通过PCR和Southern blot检测,从83只出生小鼠中获得6只整合人溶菌酶融合基因的转基因小鼠.对F1代小鼠的PCR检测表明外源基因可以遗传给后代.在3只转基因阳性母鼠的乳汁中,用Western blot方法可以检测到重组人溶菌酶的存在,最高表达量达到0.2 mg/mL.经活性检测,转基因小鼠乳清的溶菌酶活性显著提高,已达到人乳清溶菌酶活性的0.4倍,而非转基因小鼠乳清具有极低的溶菌酶活性.尽管转基因小鼠乳清中重组人溶菌酶活性还低于人乳清中溶菌酶活性,但是转基因小鼠乳汁中的重组人溶菌酶与人溶菌酶具有相同的比活力.为乳腺生物反应器表达重组人溶菌酶的研究和开发应用打下了坚实的基础.