肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。

山羊SOX2多克隆抗体制备

【目的】构建山羊Sox2原核表达载体—pRSET-Sox2,并将诱导表达、纯化的His-Sox2融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备Sox2多克隆抗体。【方法】从pMD18T-Sox2载体上以Bam H I和Xho I双酶切截取Sox2片段,然后将其亚克隆到pRSET-A表达载体上,获得pRSET-Sox2重组质粒。转化了pRSET-Sox2的大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol.L-1 IPTG 37℃诱导4 h,SDS-PAGE电泳及Western blotting检测融合蛋白表达。相同条件下大量增菌诱导,用Ni-NTA argrose介质分离纯化His-Sox2重组蛋白。将体外复性的融合蛋白皮下注射新西兰大白兔,间隔2—3周注射一次,共4次。最后一次注射后7 d,采血分离血清,用Western blotting检测抗体特异性。【结果】(1)原核表达载体pRSET-Sox2在大肠杆菌BL21(DE3)得到了高效表达;(2)纯化的His-Sox2融合蛋白能够满足多克隆抗体制备的要求;(3)经Western blotting检测,Sox2多克隆抗体能与His-Sox2融合蛋白特异性结合。【结论】制备了高特异性山羊Sox2多克隆抗体,为深入探讨山羊Sox2基因的生物学功能奠定了基础,也为山羊(iPS)细胞检测创造了良好条件。

山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化

本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白。应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体。重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmol.L-1IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku)。结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件。

池蝶蚌Sox2基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用,为研究池蝶蚌中Sox基因的功能,以人SRY基因HMG-box保守区的序列设计简并引物,以雌、雄池蝶蚌基因组DNA和精巢cDNA为模板进行扩增,获得了2个不完全相同的序列,分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2和cDNA-HMG,长度均为220 bp,编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3及Sox14有很高的同源性,雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2部分cDNA片段,长度为1774 bp,该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2的同源性最高;在部分开放阅读框249个氨基酸残基中,具有Sox家族典型的HMG-box结构域,与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2的HMG-box同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8种组织hs-Sox2的表达情况,结果显示,hs-Sox2基因在8种组织中均有表达,其中在肾脏中的表达量最高,其次是肠与闭壳肌,在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺,在肝脏中的表达量最低;为了解hs-Sox2在不同性腺发育时期的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了5个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2的表达情况,结果显示在39月龄性腺的表达量最高,其次是16月龄性腺,63月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明,hs-Sox2基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。

纤维支气管镜活检组织Sox2基因对肺癌的诊断价值

目的探讨纤维支气管镜活检组织标本中干细胞标志物Sox2 mRNA对肺癌的诊断价值。方法采用RT-PCR技术检测100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纤维支气管镜活检标本中Sox2 mRNA的表达,随后利用免疫组化技术验证Sox2蛋白在50例肺癌组织、32例良性病变肺组织和18例癌旁正常肺组织间表达的差异,分析Sox2mRNA表达与肺癌临床病理参数的关系及其在肺癌诊断中的潜在价值。结果 Sox2 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达量显著高于非癌肺组织(P<0.05)。肺癌患者不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移,Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义。Sox2 mRNA ROC曲线下面积为0.748,临界值取0.513时,其灵敏度和特异度分别为85.0%和61.1%。结论纤维支气管镜活检组织标本Sox2 mRNA可能是肺癌诊断的有效标志物。

人Sox2基因的克隆表达和纯化

应用RT-PCR方法从人胚胎干细胞中扩增出Sox2基因,构建pET28b-Sox2表达载体.用IPTG诱导转化pET28b-Sox2表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并优化表达条件为37℃IPTG0.8 mmol/L诱导4 h.以Ni-NTA亲和层析法纯化Sox2重组蛋白,对变性蛋白进行柱上和透析复性,复性后蛋白得率为0.7 mg/g湿菌重.

SOX2基因在胶质瘤中的表达及生物学作用

目的探讨SOX2基因在人胶质瘤中的表达水平、甲基化状态以及生物学作用。方法选取人胶质瘤组织标本108例,正常脑组织30例。采用PCR的方法检测SOX2基因的表达水平和甲基化状态。MTT和软琼脂集落形成试验检测SOX2对胶质瘤U87和U251细胞的生物学作用。结果 SOX2在正常脑组织中的相对表达水平明显低于胶质瘤组织(P<0.01)。SOX2基因启动子区非甲基化比率在胶质瘤中分别为:Ⅰ级23.5%(4/17),Ⅱ级34.8%(8/23),Ⅲ级51.4%(19/37),Ⅳ级64.5%(20/31),高级别组(57.4%)与低级别组(30.0%)相比具有统计学差异(P<0.01)。过量表达SOX2基因可促进胶质瘤U87和U251细胞增殖和集落形成能力。结论 SOX2基因在胶质瘤组织高表达,其在胶质瘤中的表达水平可能受启动子区域甲基化状态影响,SOX2基因影响胶质瘤的肿瘤学特性。

SOX2在结直肠癌组织中的表达与临床病理学意义

目的:探讨结直肠癌组织中SOX2的表达及与结直肠癌临床病理特征的关系,为指导结直肠癌的临床治疗及预后判断提供重要依据。方法:收集150例结直肠癌组织标本,采用LSAB免疫组化法检测癌组织中SOX2的表达。采用实时RT-PCR检测其中3例癌组织及癌旁组织中SOX2mRNA的表达情况,分析SOX2蛋白表达与肿瘤临床病理的相关性。结果:SOX2阳性表达主要位于结直肠癌癌细胞的细胞核内,且在127例呈中高表达(表达率84.6%)显著高于例癌旁结直肠组织中的高表达(8%,P<0.01)。SOX2mRNA在结直肠癌组织的表达水平是癌旁结直肠组织的2.5～15倍。SOX2蛋白表达与结直肠癌患者的年龄、性别以及肿瘤部位、大小等无相关性(P>0.05),但与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移、Dukes’分期有显著相关性(P<0.01)。结论:结直肠癌组织中SOX2蛋白和mRNA的表达显著高于癌旁结直肠组织,其表达与结直肠癌的浸润深度、分化程度、淋巴结转移、Dukes’分期有关。

人脂肪干细胞的生物学鉴定和多能性分子Oct4和Sox2的表达研究

目的探讨人脂肪干细胞(ASCs)多能性分子Oct4和Sox2的表达情况。方法利用胶原酶将人脂肪组织消化后,分离培养得到ASCs,绘制细胞生长曲线;应用流式细胞仪检测不同代数的P2、P3、P5的ASCs的表面标志物;应用诱导分化培养基诱导ASCs朝成脂、成软骨和成骨方向分化,分化后分别行油红O、阿尔辛蓝和茜素红特殊染色鉴定;应用免疫荧光技术分析P1、P2、P5、P6细胞中Oct4和Sox2的表达情况。结果原代及传代后各代ASCs呈成纤维样贴壁生长,形态均一,细胞群体倍增时间为31 h。各代ASCs均表达CD29、CD44、CD90(>90%)和CD105(>50%),不表达CD34和CD45(<1%);成脂、成软骨和成骨诱导后染色鉴定结果均为阳性;Oct4在P1、P2细胞中的表达位于细胞核内,而在P5、P6细胞的表达则位于胞质;Sox2在P1、P2细胞的胞质中表达,而在P5、P6细胞的胞质中几乎不表达。结论 ASCs具有间充质来源干细胞的一些共同特性及间充质谱系的多向分化潜能。多能性分子Oct4和Sox2在不同代数ASCs中的表达量及表达位置有一定差异,可能反应了各代ASCs分化潜能有所不同。

Sox2在胶质母细胞瘤中的研究进展

胶质母细胞瘤(GBM)属于世界卫生组织(WHO)Ⅳ级恶性肿瘤,是除脑干胶质瘤外预后较差的中枢神经系统癌症,发病率占人原发性恶性脑肿瘤的80%,患者5年生存率仅有5%。Sox2是一种多能性调节子,越来越多的证据表明,Sox2的突变及其功能异常与GBM的发生密切相关。已有研究证实利用Sox2基因作为GBM治疗靶点具可行性。本文在此将Sox2在GBM中的新研究进展进行综述。

水牛SOX2基因5′调控序列的克隆与功能分析

为探讨水牛SOX2基因的转录调控机制,本试验克隆获得其长2555bp的5′调控序列片段,结合生物信息分析设计了-2263、-1816、-1275、-660和-407bp 5个缺失体,并分别构建其EGFP表达报告载体,通过生产转基因早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析各缺失体片段的转录活性。结果发现,除-407bp以外的各缺失体在猪4.5d早期胚胎细胞中均能成功启动下游EGFP的表达,且随着片段缩短,其转录活性呈极显著递减趋势(P<0.01);而转染水牛成纤维细胞48h后,除p-407-EGFP以外的各缺失体报告载体转染组均观察到少数细胞发光,转录活性两两之间差异均极显著(P<0.01),转录活性从高到底排布分别为-2263、-660、-1275和-1816bp。p-407-EGFP载体在胚胎水平和细胞水平均未观察到荧光。以上结果表明,-660～-407bp是构成水牛SOX2基因表达不可缺失的部分,-2263～-1816bp中有非多能细胞特异性的增强子元件存在,而-1816～-1275bp和-1275～-660bp均含有多能性细胞特异性的增强子元件。

沉默干细胞转录因子Sox2对宫颈癌细胞增殖能力影响的研究

目的探讨沉默干细胞转录因子Sox2对宫颈癌细胞增殖能力的影响及其机制。方法将干扰质粒(shRNA-Sox2)转染宫颈癌C33A细胞系,利用嘌呤霉素筛选出稳定沉默Sox2表达的C33A细胞克隆株(shRNA-Sox2-C33A)。MTT、克隆形成实验检测沉默Sox2表达对宫颈癌细胞增殖能力的影响;流式细胞仪检测细胞周期的变化;Western blot检测细胞周期素CyclinD1的表达变化。结果 shRNA-Sox2转染C33A细胞后,细胞中Sox2 mRNA表达下调(t=7.94,P<0.01)。干扰组细胞(shRNA-Sox2-C33A)增殖速度低(t=10.93,P<0.05),体外克隆形成率显著下降(t=8.30,P<0.01);细胞周期中G0/G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少(t值分别为-4.60、4.67,均P<0.05);Western blot检测CyclinD1表达下调(t=113.79,P<0.05)。结论沉默Sox2基因表达可能通过下调CyclinD1来阻滞细胞从G1期细胞进入S期,抑制宫颈癌细胞增殖。

Sox2-R_9-EGFP融合蛋白的表达及穿膜能力鉴定

构建、表达、纯化、鉴定Sox2-R9-EGFP融合蛋白,验证其在体外培养的成纤维细胞中的转导活性。以胎猪原始生殖嵴为材料提取总RNA,反转录成cDNA第一链,设计带9聚精氨酸(R9)的特定引物,从cDNA中扩增出猪Sox2基因,克隆到pET-28a-EGFP载体中,经酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,Ni2+柱亲和层析纯化和SDS-PAGE检测表达产物后,将Sox2-R9-EGFP蛋白作用于体外培养的猪胎儿成纤维细胞中以观察其转导活性。成功构建Sox2-R9-EGFP融合蛋白原核表达载体,纯化后蛋白经SDS-PAGE检测证实融合蛋白片段大小正确,加到培养的猪胎儿成纤维细胞中可观察到Sox2-R9-EGFP融合蛋白能进入细胞,且部分可定位于细胞核。获得了Sox2-R9-EGFP原核蛋白表达载体,R9能介导Sox2蛋白进入细胞,为进一步利用重组蛋白建立诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS细胞)的研究奠定了基础。

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞(NIH3 T3细胞)后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX-Sox2-IRES-GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3 T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据。

人Sox2和Nanog基因的克隆及其对胎肺成纤维细胞分化的影响

目的克隆人Sox2、Nanog基因编码序列,构建pSG5-Sox2及pSG5-Nanog真核表达重组质粒,转染胎肺间质成纤维细胞,观察Sox2、Nanog基因表达并鉴定其功能。方法应用RT-PCR方法分别从4～6周龄流产胎儿脑组织和膀胱癌细胞中扩增出Sox2及Nanog基因编码全序列,将其连接至pSG5表达载体。经测序比对后,将重组质粒pSG5-Sox2及pSG5-Nanog转染胎肺成纤维细胞,采用免疫细胞化学法检测Sox2及Nanog基因表达情况,倒置显微镜观察转染前后细胞的形态学变化。结果人Sox2基因和Nanog基因编码序列全长957bp和934bp,重组质粒pSG5-Sox2、pSG5-Nanog测序成功,BLAST比对成功,转染胎肺成纤维细胞后,免疫细胞化学检测到Sox2、Nanog阳性表达。转染后胎肺成纤维细胞形态学先呈现干细胞样变化,进而分化为上皮样细胞,CK(广谱)染色阳性,并有向神经细胞分化的趋势,巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经元特异性烯醇化酶染色阳性。结论克隆了人Sox2、Nanog基因,成功转染胎肺成纤维细胞并检测到基因阳性表达,胎肺间质成纤维细胞呈干细胞样生长并有向上皮及神经样细胞分化的趋势,为进一步研究Sox2和Nanog基因功能及重编程细胞分化奠定了基础。

Sox2基因真核表达载体的构建及转Sox2基因绵羊骨髓间充质干细胞系的建立

Sox2是多能干细胞的主要标记之一,有研究发现高表达Sox2基因的神经干细胞作为供体细胞进行核移植时具有较高的重编程能力。本研究旨在通过对绵羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)Sox2基因进行外源性增强表达,以期提高其重编程能力,从而改善动物体细胞克隆效率。试验提取绵羊胎儿生殖腺组织RNA,以其为模板克隆Sox2基因cDNA序列,装入真核表达载体pEGFP-N1,构建出pEGFP-N1-Sox2表达载体。经脂质体转染将重组质粒转染入绵羊BMSC,经G418与荧光标记双筛选后挑选单克隆并扩增培养。测序鉴定表明,克隆得到绵羊Sox2基因CDS区全长,重组质粒构建成功;荧光检测表明,成功建立表达Sox2基因的绵羊BMSC系。本研究得到了高表达Sox2基因的绵羊BMSC系,为提高体细胞克隆过程中的重编程效率提供了新思路。

绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测

为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。

猪早期胚胎发育中SOX2基因启动子活性分析

转录因子SOX2(sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254~2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。

绵羊成纤维细胞及精子Sox2基因启动子甲基化状态检测

为了探明绵羊成纤维细胞及精子中Sox2基因启动子甲基化状态的差异,试验对绵羊Sox2基因启动子进行序列查询和甲基化岛分析,提取绵羊成纤维细胞和精子基因组,用重亚硫酸盐处理,进行甲基化特异性PCR、连接和酶切鉴定,最终分别随机选取10个测序结果进行甲基化状态分析,比较二者的甲基化状态。结果表明:在精子的350个甲基化位点中,有194个位点处于非甲基化状态,156个位点处于甲基化状态,甲基化率为44.6%;在成纤维细胞的350个甲基化位点中,93个位点处于非甲基化状态,257个位点处于甲基化状态,甲基化率为73.4%;χ~2检验表明二者的甲基化状态差异极显著(P<0.01)。说明绵羊精子和成纤维细胞的Sox2基因启动子区域甲基化状态存在较大差异。

共表达外源OCT4/SOX2可激活人胚肾细胞中内源NANOG的表达

自2006年诱导多能干细胞(iPS)技术诞生以来,采用病毒等载体进行的诱导方法已取得了成功.但是,其致瘤性的影响限制了病毒载体的推广与应用,而采用非病毒载体诱导iPS细胞成为研究的热点.本研究通过2个启动子的独立启动,构建了带有绿色荧光标记的OCT 4/SOX 2共表达诱导载体(pOct4/Sox2-EGFP).将该载体转染HEK 293FT细胞后,阳性克隆明显表达绿色荧光.并通过RT-PCR、免疫荧光等方法证明其中的转录因子OCT 4和SOX 2能在转染细胞中高效表达,同时诱导受体细胞中内源NANOG的转录表达.本研究说明,OCT 4/SOX 2共表达载体能激活NANOG基因的内源表达,暗示着非病毒不整合载体pOct4/Sox2-EGFP本身或与其它转录因子和小分子结合可用于诱导成体细胞的重编程.因此,本研究为下一步应用质粒载体诱导体细胞重编程为iPS细胞的研究奠定了工作基础.