LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT在糖尿病肾病患者中的表达及与肾功能的相关性研究

目的探究长链非编码RNA锌指E盒结合同源盒蛋白1反义链1(LncRNA ZEB1-AS1)和长链非编码RNA性别决定相关基因簇2重叠转录本(LncRNA SOX2OT)在糖尿病肾病(DN)患者中的表达及与肾功能的相关性。方法选取于2021年11月—2023年12月在武汉大学人民医院肾内科收治的DN患者106例为DN组,并根据24 h尿蛋白定量(24 h Upro)水平分为正常蛋白尿亚组43例(<30 mg)、微量蛋白尿亚组39例(30~<300 mg)、大量蛋白尿亚组24例(≥300 mg),另选取同期医院单纯糖尿病患者106例作对照组,检测患者血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平;Pearson法分析LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT与肾功能指标的相关性;Logistic分析影响DN患者肾功能损伤的因素。结果DN组血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平低于对照组(t=11.471、10.257,P均<0.001)。血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT比较,正常尿蛋白亚组>微量尿蛋白亚组>大量尿蛋白亚组(F=58.720、117.722,P均<0.001),BUN、SCr、UA水平比较,正常尿蛋白亚组<微量尿蛋白亚组<大量尿蛋白亚组,差异均有统计学意义(F=122.493、595.589、53.178,P均<0.001);LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT分别与BUN、SCr、UA呈负相关(r=-0.487、-0.498、-0.521,-0.527、-0.515、-0.534,P均<0.001);Logistic回归分析显示,糖尿病病程长及高BUN、SCr、UA水平是影响DN患者肾功能损伤的危险因素[OR(95%CI)=1.672(1.128~2.479)、2.839(1.534~5.253)、2.754(1.512~5.017)、2.693(1.464~4.954)],高LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT是保护因素[OR(95%CI)=0.875(0.798~0.959)、0.898(0.832~0.969)]。结论血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平与DN患者肾功能有关,可能是评估DN患者肾功能的潜在指标。

肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的:肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因(p53)、蛋白基因产物(PGP9.5)、转录因子(SOX2)、肿瘤相关基因编码蛋白(GAGE7)、解旋酶(GBU4-5)和黑色素瘤抗原(MAGE A1)蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法:回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果:肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05);将其与肿瘤的临床病理学特征进行相关分析发现,肿瘤组织和外周血中的p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的阳性率和基因表达水平与肿瘤TNM分期和分化级别有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤直径、病理学类型无关(P>0.05)。肿瘤组织中6种蛋白的表达水平与外周血清表达具有较好的一致性(P>0.05)。结论:肺癌肿瘤组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表达阳性与肿瘤TNM分期及分化级别密切相关。

SOX2蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义

目的研究SOX2蛋白在结直肠癌中的表达及临床意义。方法收集80例结直肠癌手术标本及20例正常的肠黏膜标本,采用免疫组化法检测SOX2蛋白在标本中的表达情况。结果 SOX2蛋白在正常肠黏膜中不表达,在结直肠癌中高表达,表达率为41.3%。SOX2表达水平与TNM分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、组织学分化程度、Ki-67和p53基因表达水平均相关(P<0.05)。SOX2高表达组患者术后的5年生存率和无瘤生存率分别为39.4%和21.2%,低表达组患者分别为95.7%和83.0%,差异有统计学意义(P=0.000)。结论 SOX2蛋白在正常结直肠黏膜组织中不表达,在结直肠癌组织中表达率高,并可作为预测结直肠癌转移和预后的生物学指标。

肿瘤干细胞标记物CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在NSCLC中的表达及临床意义

目的探讨肿瘤干细胞标记物CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学方法,检测70例NSCLC组织中CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1蛋白的表达情况。结果 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在70例NSCLC组织中阳性表达率分别为88.57%、98.57%、100.00%、100.00%、100.00%,强阳性表达率分别为48.57%、67.14%、67.14%、31.43%、50.00%;NSCLC组织中CD44与SOX2共表达分析存在统计学意义(P=0.028);70例NSCLC中CD44++SOX2++组合占38.57%(27/70),CD44++ALDH1++组合占34.29%(24/70),SOX2++ALDH1++组合占34.29%(24/70),CD133++SOX2++组合占31.43%(22/70),双强阳性NSCLC组织与非双强阳性NSCLC组织比较,病理分化程度方面均有差别,双强阳性NSCLC组织多为中、低分化,而非双强阳性NSCLC组织倾向高分化。上述4种双强阳性组织与非双强阳性组织在病理分化程度上比较,均有统计学意义(P值分别为0.0022、0.0463、0.0463、0.003)。结论 NSCLC组织中OCT4、CD44、SOX2、CD133、ALDH1表达阳性率高;CD44与SOX2存在共表达关系;双强阳性组合CD44++SOX2++、CD44++ALDH1++、SOX2++ALDH1++、CD133++SOX2++,有可能对研究NSCLC干细胞标记物有一定的帮助。

山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化

本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白。应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体。重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmol.L-1IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku)。结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件。

山羊SOX2多克隆抗体制备

【目的】构建山羊Sox2原核表达载体—pRSET-Sox2,并将诱导表达、纯化的His-Sox2融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备Sox2多克隆抗体。【方法】从pMD18T-Sox2载体上以Bam H I和Xho I双酶切截取Sox2片段,然后将其亚克隆到pRSET-A表达载体上,获得pRSET-Sox2重组质粒。转化了pRSET-Sox2的大肠杆菌BL21(DE3),1 mmol.L-1 IPTG 37℃诱导4 h,SDS-PAGE电泳及Western blotting检测融合蛋白表达。相同条件下大量增菌诱导,用Ni-NTA argrose介质分离纯化His-Sox2重组蛋白。将体外复性的融合蛋白皮下注射新西兰大白兔,间隔2—3周注射一次,共4次。最后一次注射后7 d,采血分离血清,用Western blotting检测抗体特异性。【结果】(1)原核表达载体pRSET-Sox2在大肠杆菌BL21(DE3)得到了高效表达;(2)纯化的His-Sox2融合蛋白能够满足多克隆抗体制备的要求;(3)经Western blotting检测,Sox2多克隆抗体能与His-Sox2融合蛋白特异性结合。【结论】制备了高特异性山羊Sox2多克隆抗体,为深入探讨山羊Sox2基因的生物学功能奠定了基础,也为山羊(iPS)细胞检测创造了良好条件。

SOX2蛋白及趋化相关基因CCR1、CCR2、MCP-1影响骨髓瘤细胞生物学特性的机制

目的揭示SOX2蛋白及趋化相关基因CCR1、CCR2和MCP-1影响骨髓瘤细胞生物学特性的机制。方法本研究以骨髓瘤细胞株H929为研究对象,采用随机数表法将细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组。空白对照组为不进行任何处理的骨髓瘤细胞株H929,阴性对照组为转染慢病毒r LV-ZPP的稳转株H929-ZPP,实验组为转染慢病毒r LV-hsox2-Zs Green-Puro的稳转株H929-hsox2。采用Western blot检测各组细胞中SOX2蛋白表达,采用实时荧光定量PCR反应(RT-PCR)测定各组细胞中CCR1、CCR2和MCP-1基因表达,相应基因的相对表达水平用2-ΔΔCT代表。采用酶标仪测定细胞在450 nm处的吸光度值,计算细胞生存率。采用流式细胞仪计算各组细胞的凋亡率。结果实验组的SOX2蛋白表达为(1.38±0.07),高于空白对照组的(1.04±0.06)和阴性对照组的(0.72±0.07),差异均有统计学意义(P<0.05);实验组的CCR1、CCR2和MCP-1基因表达水平分别为(4.37±0.33)、(4.45±0.38)、(10.72±1.14),高于空白对照组的(2.14±0.15)、(2.21±0.17)和(5.17±0.35)和阴性对照组的(1.22±0.10)、(1.16±0.09)和(1.59±0.09),差异均有统计学意义(P<0.05);实验组的细胞生存率为(40.53±2.21)%,低于空白对照组的(86.85±5.17)%和阴性对照组的(95.07±7.08)%,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组的细胞凋亡率为(58.56±3.25)%,高于空白对照组的(12.15±1.14)%和阴性对照组的(4.93±2.12)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SOX2基因在细胞周期中特定时期的高表达会导致骨髓瘤细胞的凋亡。CCR1、CCR2和MCP-1基因参与了骨髓瘤细胞恶性增殖,其在细胞中的异常表达为骨髓瘤细胞提供合适的环境,导致疾病复发和抗凋亡的发生。

MRI纹理联合Cripto-1与SOX2蛋白对甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的诊断价值

目的:分析磁共振成像(MRI)T_(2)加权成像(T_(2)WI)纹理联合Cripto-1与SOX2蛋白在甲状腺乳头状癌(PTC)颈部淋巴结转移(LNM)中的诊断价值。方法:选择82例PTC患者,并留取患者根治术标本进行后期免疫组化研究。根据入选患者病理诊断结果,将42例LNM阳性者分为观察组,40例LNM阴性者分为对照组。分析MRI纹理参数联合Cripto-1与SOX2蛋白诊断PTC伴LNM的敏感度、特异度及符合率的临床价值。结果:Cripto-1蛋白在伴LNM的PTC中的阳性表达显著强于未伴LNM的PTC中的阳性表达(P<0.05)。Cripto-1蛋白免疫组化染色阳性表达多位于肿瘤周围组织,表现为棕黄色颗粒,主要位于细胞膜上,且Cripto-1蛋白在伴LNM的PTC中染色强度显著强于未伴LNM的PTC。SOX2蛋白在伴LNM的PTC中的阳性表达显著强于未伴LNM的PTC中的阳性表达(P<0.05)。SOX2蛋白免疫组化染色阳性表达多位于肿瘤周围组织,表现为棕黄色颗粒,主要位于细胞核上,且SOX2蛋白在伴LNM的PTC中染色强度显著强于未伴LNM的PTC。两组T_(2)WI图像纹理分析的熵、角二阶矩以及相关间具有统计学意义(P<0.05),而逆差矩、偏度、对比、峰度以及均值间均无统计学意义(P>0.05)。预测PTC伴LNM的熵、角二阶矩以及相关对应AUC分别为0.884、0.783、0.718,敏感度分别为97.13%、79.42%、44.14%,特异度分别为70.00%、60.00%、90.00%。MRI纹理参数对PTC伴LNM的诊断价值稍优于Cripto-1蛋白,差异无统计学意义(P>0.05);而MRI纹理参数联合Cripto-1与SOX2蛋白诊断在敏感度、特异度及符合率方面均显著优于单独诊断(P<0.05)。结论:MRI纹理联合Cripto-1与SOX2蛋白诊断PTC伴LNM的敏感度、特异度及符合率均高于单独MRI纹理参数或Cripto-1蛋白的检查。此外,其有望为PTC患者预后及其治疗决策提供更可靠、准确的依据。

穿膜肽引导的体外表达转录因子蛋白Sox2进入红鳍东方鲀精巢细胞系

为了探索适用于体外培养的鱼细胞外源基因转入方法,本研究通过构建红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)转录因子Sox2的重组表达载体p ET32a(+)-Sox2-11R-6His,诱导表达并纯化得到了C末端连接多聚精氨酸(11R)的重组蛋白Sox2-11R-6His,以其与红鳍东方鲀精巢细胞系细胞共孵育12 h后,光镜观察结合Western Blot检测发现重组蛋白进入细胞的效率与浓度呈剂量依赖关系且最佳孵育浓度为8μg/m L,当重组蛋白质量浓度达到10μg/m L时,表现出明显的细胞毒性。对外源蛋白进行免疫荧光标记定位,发现重组蛋白分布于细胞质,部分进入到细胞核中。证明了穿膜肽11R可以有效运载转录因子重组蛋白至红鳍东方鲀的细胞系细胞中。本研究旨在将广泛应用于哺乳动物的细胞基因递送载体穿膜肽应用于鱼类细胞系细胞。

Sox2-R_9-EGFP融合蛋白的表达及穿膜能力鉴定

构建、表达、纯化、鉴定Sox2-R9-EGFP融合蛋白,验证其在体外培养的成纤维细胞中的转导活性。以胎猪原始生殖嵴为材料提取总RNA,反转录成cDNA第一链,设计带9聚精氨酸(R9)的特定引物,从cDNA中扩增出猪Sox2基因,克隆到pET-28a-EGFP载体中,经酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,Ni2+柱亲和层析纯化和SDS-PAGE检测表达产物后,将Sox2-R9-EGFP蛋白作用于体外培养的猪胎儿成纤维细胞中以观察其转导活性。成功构建Sox2-R9-EGFP融合蛋白原核表达载体,纯化后蛋白经SDS-PAGE检测证实融合蛋白片段大小正确,加到培养的猪胎儿成纤维细胞中可观察到Sox2-R9-EGFP融合蛋白能进入细胞,且部分可定位于细胞核。获得了Sox2-R9-EGFP原核蛋白表达载体,R9能介导Sox2蛋白进入细胞,为进一步利用重组蛋白建立诱导性多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS细胞)的研究奠定了基础。

可溶性Sox2-11R重组蛋白的制备与鉴定

旨在通过原核表达制备可溶性Sox2-11R重组蛋白,并验证其穿膜能力。首先,采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)与蛋白转导域11聚精氨酸(11 arginine,11R)的融合表达和与成纤维细胞的共孵育验证11R的穿膜能力。其次,将目的基因Sox2-11R在原核表达载体pET30a中表达,通过优化表达条件获取可溶性Sox2-11R重组蛋白。最后,利用Ni柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定;并用免疫荧光染色验证重组蛋白是否具有进入细胞核的能力。结果表明,成功构建了pET30a-Sox2-11R原核表达载体,纯化的Sox2-11R重组蛋白具有穿膜能力,且在细胞培养基中具有较高溶解度,这为制备其他重编程因子的重组蛋白提供了参考,也为外源蛋白诱导iPSCs奠定了基础。

SOX2、SOX7蛋白在喉癌及癌旁组织中的表达及其临床意义

目的检测SOX2蛋白、SOX7蛋白、β-连环蛋白(β-catenin)及细胞周期素(CyclinD1)蛋白在喉癌及癌旁正常上皮组织中的表达,并初步探讨其在喉癌发生中的临床意义。方法将收集到的65例喉癌组织和其中40例对应癌旁正常上皮组织的石蜡切片进行免疫组化染色,检测SOX2、SOX7、β-catenin及CyclinD1蛋白的表达。结果SOX2、β-catenin及CyclinD1蛋白在喉癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常上皮组织(P<0.05),SOX7蛋白在喉癌组织中的阳性表达率低于癌旁正常上皮组织(P<0.05);喉癌组织中SOX2、SOX7、β-catenin及CyclinD1蛋白的阳性表达率与淋巴结转移及T分期相关(P<0.05),与吸烟、饮酒、年龄、性别、分化程度、临床分型等均无相关性(P>0.05);在喉癌组织中β-catenin和cyclinD1与SOX2蛋白的表达呈正相关(φ=0.732,P<0.001;φ=0.844,P<0.001),与SOX7蛋白的表达呈负相关(φ_(SOX7与β-catenin)=-0.213,P<0.001;φ_(SOX7与cyclinD1)=-0.455,P<0.001),且β-catenin与cyclinD1的表达呈正相关(φ=0.661,P<0.001),SOX2与SOX7的表达呈负相关(φ=-0.388,P=0.002)。结论SOX2、β-catenin及CyclinD1蛋白在喉癌组织中高表达,SOX7蛋白在喉癌组织中低表达,推测SOX2、SOX7蛋白可能对喉癌的进展有一定影响。

Sox2蛋白在结直肠管状腺瘤及腺癌中的表达及临床意义

目的:观察和检测Sox2蛋白在结直肠管状腺瘤及腺癌中的表达情况及临床意义。方法:选取本院收治的结直肠管状腺瘤50例及腺癌50例为研究对象。根据不典型增生程度将结直肠管状腺瘤分为低级别管状腺瘤组(n=30)和高级别管状腺瘤组(n=20);根据分化程度将腺癌分为高分化腺癌组(n=8)、中分化腺癌组(n=26)、低分化腺癌组(n=16)。采用免疫组化的方法,探讨Sox2蛋白在结直肠管状腺瘤及腺癌中的不同表达情况及临床意义。结果:低级别管状腺瘤组Sox2的表达阳性率为10.00%(3/30),低于高级别管状腺瘤组的40.00%(8/20),比较差异有统计学意义(P<0.05);不同分化程度腺癌中Sox2的表达阳性率比较,差异有统计学意义(χ~2=22.563,P=0.010)。结论:Sox2蛋白表达水平在结直肠管状腺瘤不典型增生的不同程度及腺癌的不同分化程度中均有不同程度的表达,检测Sox2蛋白对了解结直肠管状腺瘤及结直肠癌的生物学行为和评估预后具有一定的临床价值。

猪转录因子SOX2下游调控蛋白筛选及调控网络建立

SOX2是早期胚胎发育与干细胞多能性维持相关的重要转录因子。从猪孤雌囊胚中克隆获得猪SOX2基因并构建对应过表达体系。通过猪pEF细胞系与PK15细胞系中过表达SOX2基因及qPCR技术,检测89个下游调控候选基因表达情况,建立猪SOX2下游调控网络。结果发现,GATA4、MSC、GSC、FGF4、STELLA、ACACA、FN1、KLF4以及MEK基因在pEF细胞系与PK15细胞系间呈差异性调控表达。BMP4、FGFR2、ACAA2、ACSL3、β-CATENIN、c-MYC、MYST3、GSK3β、ALDH3A2、STAT3、SMAD2、KDM6A、ACADL、PI3K与WDR3基因在两种细胞系中呈同趋势性调控表达;经JASPAR数据库预测发现,WDR3、β-CATENIN、ACAA2、KDM6A、STAT3、ACADL、GSK3β与ALDH3A2基因启动子区域存在高相关性的SOX2蛋白结合位点,推测这些基因受SOX2蛋白直接调控;同时构建针对猪SOX2基因的高效敲除体系。研究结果为建立物种特异性的猪SOX2调控网络提供数据基础。

酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞中OCT4与SOX2蛋白水平的影响

目的·探究酶消化细胞团块法对人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)的八聚体结合转录因子4(octamerbinding protein 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2,SOX2)蛋白水平的影响及可能的作用机制。方法·(1)利用Western blotting分析检测酶消化细胞团块法[分散酶Dispase或胶原酶Ⅳ(collagenase typeⅣ,COL4)]、酶消化单细胞法(细胞分离溶液Accutase或胰酶)和机械刮取法对hESC中OCT4和SOX2蛋白水平的影响。(2)使用金属离子螯合剂乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)破坏hESC-hESC细胞间连接,然后利用Western blotting检测EGTA单独处理或联合COL4处理对hESC中OCT4与SOX2的蛋白水平的影响。(3)通过基于质谱的定量蛋白质组学技术,检测COL4单独处理或与EGTA联合处理hESC细胞样本中差异表达的磷酸化蛋白和总蛋白,并进行功能富集分析。(4)利用Western blotting和免疫荧光染色检测蛋白酶体抑制剂bortezomib或溶酶体抑制剂氯喹预处理对COL4引起的hESC中OCT4与SOX2蛋白水平下调的影响。(5)利用Western blotting检测COL4对丝切蛋白(cofilin)的影响,以及Rac1小分子抑制剂EHT1864和EHop-016对SOX2蛋白表达水平的影响。结果·(1)COL4和Dispase引起OCT4和SOX2的蛋白水平下降;Accutase、胰酶和机械刮取法未观察到此作用。(2)EGTA处理能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降。(3)蛋白质谱和功能富集分析发现,COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降可能与肌动蛋白微丝(actin filament,F-actin)、微管和溶酶体相关蛋白的变化有关。(4)氯喹能够抑制COL4消化hESC引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降,bortezomib则不能。(5)COL4处理或Rac1抑制剂均能下调cofilin和SOX2的蛋白水平。结论·当使用酶消化细胞团块法处理hESC时,OCT4和SOX2蛋白水平下降,Rac1/cofilin/F-actin信号通路和溶酶体可能参与其中。

同源域蛋白Nanog与胚胎干细胞的自我更新研究进展

胚胎干细胞作为一种具有自我更新能力的细胞,可以在体外无限对称性分裂,同时保持未分化状态,具有向各种类型细胞分化的潜能。基于这一特性,胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)有着极其广阔的应用前景。维持ES细胞自我更新的机制至今尚未阐明,推测ES细胞的自我更新机制是一个包括细胞外刺激、细胞内多种因子共同参与的复杂的网络调节系统。近年来发现同源域蛋白Nanog在这个网络调节系统中处于中心地位,对ES细胞自我更新的维持起着关键作用。本文就近年来关于Nanog在ES细胞自我更新维持中的作用,以及它与其他信号通路之间的对话,阐明ES细胞自我更新的维持机制。

蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的构建

【目的】构建一种可获得Sumo修饰蛋白的原核表达系统,为Sumo化修饰蛋白的批量制备奠定基础。【方法】用Trizol裂解法提取小鼠畸胎瘤细胞F9的总RNA,反转录成cDNA后PCR扩增获得Sumo1、Ubc9、Sae2和Sae1基因。将上述基因及相应载体酶切、连接后构建出重组质粒pACYC-Ubc9-Sumo1、pCDF-Sae2-Sae1。采用质粒转化-制备阳性克隆感受态细胞-质粒转化的方法获得pACYC-Ubc9-Sumo1和pCDF-Sae2-Sae1共表达的Su-mo化修饰的原核表达系统。以pGEX-GST-Sox2和pGEX-GST-Sox2K247R重组质粒为例,采用Western Blot检测蛋白质Sumo化修饰原核表达系统的有效性。用另一Sumo修饰底物Oct4及其Sumo修饰位点突变的突变体Oct4K118R转化原核Sumo修饰系统,并连续传代,检测蛋白质Sumo化修饰系统的实用性及遗传稳定性。【结果】构建的蛋白质Sumo化修饰原核表达系统可特异修饰Sumo1的底物Sox2和Oct4;含有Oct4原核表达载体的蛋白质Sumo化修饰系统可稳定传至15代,系统的稳定性较好。【结论】获得了成本较低、特异性强、重复性好、稳定性强的可用于制备Sumo化蛋白的原核表达系统。

胃癌患者Sox2蛋白和CTHRC-1蛋白的表达与肿瘤发展密切相关

本研究选取病理科收集的自2016年1月至2016年12月的90例术后胃癌组织标本(胃癌组)、45例癌旁组织标本(对照组),采用免疫组化染色法检测两组标本中的Y框蛋白(Sox2)、胶原三股螺旋重叠蛋白-1表达,并分析其与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度的关系,采用Spearman秩相关检验检测两种蛋白的相互关系,试图探讨胃癌患者癌组织中性别决定区Y框蛋白(Sox2)、胶原三股螺旋重叠蛋白-1(CTHRC-1)的表达及其相关性。研究结果表明:胃癌组的Sox2蛋白阳性表达率63.33%显著低于对照组的93.33%(p<0.05),胃癌组的CTHRC-1蛋白阳性表达率78.89%显著高于对照组的24.44%(p<0.05);胃癌组的Sox2蛋白阳性表达与胃癌的分化程度、发生淋巴结转移具有相关性(p<0.05);胃癌组的CTHRC-1蛋白阳性表达与胃癌的淋巴结转移、TNM分期、肿瘤浸润深度具有显著的相关性(p<0.05);胃癌组的Sox2蛋白与CTHRC-1蛋白呈显著的负相关表达(Spearman相关系数r=-0.322, p=0.002<0.05)。本研究的初步结论表明:胃癌组织中Sox2蛋白低表达和CTHRC-1蛋白高表达,并且与肿瘤发展密切相关,且二者表达呈负相关。

Tat融合蛋白表达载体TAT-SOX2的克隆化及蛋白表达研究

目的 构建重组表达载体TAT-SOX2,在E.coli BL21中高效表达并纯化融合蛋白.方法 经PCR获得编码人SOX2的全基因序列,连接到原核表达载体PET-28b-TAT-V2上,得到重组表达载体TAT-SOX2,转化大肠埃希菌,IPTG诱导TAT-SOX2融合蛋白的表达.表达产物用SDS-PAGE鉴定,亲和层析柱纯化融合蛋白,并应用Western Blot检测蛋白的特异性,应用免疫荧光检测融合蛋白转导HSF细胞的效果.结果 成功构建了TAT-SOX2融合蛋白的原核表达载体,在诱导下获得了高效表达并纯化了融合蛋白,Western Blot鉴定正确.免疫荧光提示融合蛋白可快速转导入HSF细胞内.结论 为进一步的通过蛋白转导方式诱导多能干细胞提供了物质基础.

多能性转录因子OCT4和SOX2在体外发育的小鼠2-细胞胚胎的表达与定位

为探讨多能性转录因子OCT4和SOX2在昆明小鼠(Mus musculus)2-细胞胚胎发育过程中与2-细胞胚胎阻滞发生的相关性,本研究应用实时荧光定量PCR技术检测了小鼠卵母细胞及在M16培养液中培养的不同发育阶段体外受精胚Oct4和Sox2基因的表达,并利用实时荧光定量PCR和免疫荧光技术比较了2-细胞胚、2-细胞阻滞胚和4-细胞胚的OCT4和SOX2的表达与定位。采用ANOVA对实验所得的数据进行分析,P<0.05被认为是具有显著性差异。研究结果显示,2-细胞胚只有24.8%发育成4-细胞胚,75.2%的2-细胞胚发生了阻滞。Sox2和Oct4的m RNA在MⅡ期卵母细胞、原核胚、2-细胞胚、4-细胞胚、桑椹胚和囊胚中都有表达。Oct4 m RNA的表达水平在4-细胞胚显著高于2-细胞胚和2-细胞阻滞胚(P<0.05),Sox2 m RNA的表达水平在2-细胞胚显著高于2-细胞阻滞胚和4-细胞胚(P<0.05),而后两者之间没有差异(P<0.05)。OCT4蛋白在2-细胞胚和4-细胞胚中与核共定位,但在2-细胞阻滞胚中弥散存在于胞质中。SOX2蛋白在以上3类胚胎中始终定位于细胞核。上述结果提示,转录因子OCT4和SOX2的表达和定位与小鼠2-细胞胚胎发育阻滞相关,母源性SOX2表达的维持对胚胎合子基因组激活(ZGA)的发生具有重要作用,母源性OCT4的异常定位可能影响了合子基因组激活相关基因的激活,而合子中Oct4的表达影响合子基因组激活后胚胎的发育。