山羊Sox2基因克隆、原核表达和GST融合蛋白纯化

本研究旨在克隆山羊Sox2基因,构建pGEX-Sox2原核表达重组质粒,从大肠杆菌中获得纯化的GST-Sox2融合蛋白。应用RT-PCR方法从6周龄胎山羊生殖嵴扩增Sox2基因编码全序列,将其克隆到pMD18-T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体。重组质粒pGEX-Sox2转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳及Western blotting检测GST-Sox2融合蛋白表达,用谷胱甘肽Sepharose 4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,山羊Sox2基因编码序列全长为960 bp;在优化的表达条件(1 mmol.L-1IPTG,22℃诱导16h)下,重组质粒(pGEX-Sox2)在大肠杆菌得到了高效表达;谷胱甘肽Sepharose 4B颗粒纯化蛋白得到预期大小的融合蛋白(约60 ku)。结论,本研究克隆了山羊Sox2基因,获得了纯化的GST-Sox2融合蛋白,为制备其多克隆抗体奠定了基础,为进一步研究山羊iPS细胞(Induced pluripotent stem cells)创造了条件。

池蝶蚌Sox2基因在不同组织及不同月龄精巢中的表达

Sox基因家族在胚胎发育过程和性别分化中起重要作用,为研究池蝶蚌中Sox基因的功能,以人SRY基因HMG-box保守区的序列设计简并引物,以雌、雄池蝶蚌基因组DNA和精巢cDNA为模板进行扩增,获得了2个不完全相同的序列,分别为DNA-HMG1、DNA-HMG2和cDNA-HMG,长度均为220 bp,编码73个氨基酸。与人等物种Sox1、Sox2、Sox3及Sox14有很高的同源性,雌雄个体之间没有序列差异性。采用RACE-PCR扩增获得了池蝶蚌性腺Sox2部分cDNA片段,长度为1774 bp,该序列核苷酸与欧洲帽贝的SoxB和人类的Sox2的同源性最高;在部分开放阅读框249个氨基酸残基中,具有Sox家族典型的HMG-box结构域,与人类、小鼠、原鸡和斑马鱼等Sox2的HMG-box同源性为98%。为了解该基因在各组织中的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了外套膜、闭壳肌、鳃、肠、肝、肾、精巢和卵巢在内的8种组织hs-Sox2的表达情况,结果显示,hs-Sox2基因在8种组织中均有表达,其中在肾脏中的表达量最高,其次是肠与闭壳肌,在雄性性腺中的表达量明显高于雌性性腺,在肝脏中的表达量最低;为了解hs-Sox2在不同性腺发育时期的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法分析了5个不同月龄的精巢组织中hs-Sox2的表达情况,结果显示在39月龄性腺的表达量最高,其次是16月龄性腺,63月龄蚌中的表达量最少。以上结果表明,hs-Sox2基因可能参与了池蝶蚌精巢的发育及功能的维持。

纤维支气管镜活检组织Sox2基因对肺癌的诊断价值

目的探讨纤维支气管镜活检组织标本中干细胞标志物Sox2 mRNA对肺癌的诊断价值。方法采用RT-PCR技术检测100例肺癌患者和18例良性肺疾病患者纤维支气管镜活检标本中Sox2 mRNA的表达,随后利用免疫组化技术验证Sox2蛋白在50例肺癌组织、32例良性病变肺组织和18例癌旁正常肺组织间表达的差异,分析Sox2mRNA表达与肺癌临床病理参数的关系及其在肺癌诊断中的潜在价值。结果 Sox2 mRNA和蛋白在肺癌组织中的表达量显著高于非癌肺组织(P<0.05)。肺癌患者不同年龄、性别、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结是否转移,Sox2 mRNA的表达差异无统计学意义。Sox2 mRNA ROC曲线下面积为0.748,临界值取0.513时,其灵敏度和特异度分别为85.0%和61.1%。结论纤维支气管镜活检组织标本Sox2 mRNA可能是肺癌诊断的有效标志物。

过表达Sox2基因可增强人骨髓干细胞向神经元分化（英文）

目的:研究Sox2对于人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元跨分化能力的影响。方法:利用Western Blot检测hBMSCs中Sox2、Oct4和c-Myc的表达,将携带Sox2和rhGFP编码序列的Tet-On慢病毒感染hBMSCs,通过多西环素(Dox)处理10 d诱导Sox2和rhGFP表达;利用神经诱导培养基诱导感染慢病毒的hBMSCs分化,通过免疫荧光染色技术检测神经元标记物Tuj1的表达;利用Western Blot技术检测Smad 2/3信号通路蛋白在hBMSCs向神经元分化过程中的表达水平。结果:Western Blot结果显示hBMSCs不仅表达Sox2和Oct4,同时还表达c-Myc;光镜下发现Sox2的过表达促进hBMSCs的形态向神经元样细胞转化,同时通过免疫荧光染色发现Tuj1的表达水平增加; Western Blot证实Sox2基因过表达引起hBMSCs中磷酸化Smad 2/3的表达水平降低。结论:Sox2可通过Smad 2/3信号通路增强人骨髓间充质干细胞向神经元分化。

鼻咽癌中SOX2基因的表达研究

目的:研究干细胞表面标志物SOX2基因在鼻咽癌中的表达,探讨对鼻咽癌诊断及治疗的潜在意义。方法:应用PCR及荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测33例鼻咽癌和21例鼻咽炎组织中SOX2基因的表达。以鼻咽炎组作为参照,对两组荧光定量PCR数值△Ct差异进行t检验,应用Li-vak(2-△△Ct)法进行相对定量分析,计算鼻咽癌中SOX2基因的表达水平。结果:78.8%(26/33)鼻咽癌和38.1%(8/21)鼻咽炎组织中存在SOX2基因的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)。鼻咽癌中57.6%(19/33)的SOX2基因表达水平比炎症组高,差异具有统计学意义(P<0.05),21.2%(7/33)鼻咽癌组织中SOX2基因表达水平比对照组低,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:鼻咽癌组中SOX2基因处于一个较高的表达水平,提示SOX2基因在鼻咽癌中出现了异常表达,是鼻咽癌肿瘤干细胞存在的一个间接证据,为从肿瘤干细胞水平上的诊断及治疗提供一个潜在的靶点。

SOX2基因在胶质瘤中的表达及生物学作用

目的探讨SOX2基因在人胶质瘤中的表达水平、甲基化状态以及生物学作用。方法选取人胶质瘤组织标本108例,正常脑组织30例。采用PCR的方法检测SOX2基因的表达水平和甲基化状态。MTT和软琼脂集落形成试验检测SOX2对胶质瘤U87和U251细胞的生物学作用。结果 SOX2在正常脑组织中的相对表达水平明显低于胶质瘤组织(P<0.01)。SOX2基因启动子区非甲基化比率在胶质瘤中分别为:Ⅰ级23.5%(4/17),Ⅱ级34.8%(8/23),Ⅲ级51.4%(19/37),Ⅳ级64.5%(20/31),高级别组(57.4%)与低级别组(30.0%)相比具有统计学差异(P<0.01)。过量表达SOX2基因可促进胶质瘤U87和U251细胞增殖和集落形成能力。结论 SOX2基因在胶质瘤组织高表达,其在胶质瘤中的表达水平可能受启动子区域甲基化状态影响,SOX2基因影响胶质瘤的肿瘤学特性。

水牛SOX2基因5′调控序列的克隆与功能分析

为探讨水牛SOX2基因的转录调控机制,本试验克隆获得其长2555bp的5′调控序列片段,结合生物信息分析设计了-2263、-1816、-1275、-660和-407bp 5个缺失体,并分别构建其EGFP表达报告载体,通过生产转基因早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析各缺失体片段的转录活性。结果发现,除-407bp以外的各缺失体在猪4.5d早期胚胎细胞中均能成功启动下游EGFP的表达,且随着片段缩短,其转录活性呈极显著递减趋势(P<0.01);而转染水牛成纤维细胞48h后,除p-407-EGFP以外的各缺失体报告载体转染组均观察到少数细胞发光,转录活性两两之间差异均极显著(P<0.01),转录活性从高到底排布分别为-2263、-660、-1275和-1816bp。p-407-EGFP载体在胚胎水平和细胞水平均未观察到荧光。以上结果表明,-660～-407bp是构成水牛SOX2基因表达不可缺失的部分,-2263～-1816bp中有非多能细胞特异性的增强子元件存在,而-1816～-1275bp和-1275～-660bp均含有多能性细胞特异性的增强子元件。

带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测

为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞(NIH3 T3细胞)后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX-Sox2-IRES-GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3 T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据。

Sox2基因真核表达载体的构建及转Sox2基因绵羊骨髓间充质干细胞系的建立

Sox2是多能干细胞的主要标记之一,有研究发现高表达Sox2基因的神经干细胞作为供体细胞进行核移植时具有较高的重编程能力。本研究旨在通过对绵羊骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)Sox2基因进行外源性增强表达,以期提高其重编程能力,从而改善动物体细胞克隆效率。试验提取绵羊胎儿生殖腺组织RNA,以其为模板克隆Sox2基因cDNA序列,装入真核表达载体pEGFP-N1,构建出pEGFP-N1-Sox2表达载体。经脂质体转染将重组质粒转染入绵羊BMSC,经G418与荧光标记双筛选后挑选单克隆并扩增培养。测序鉴定表明,克隆得到绵羊Sox2基因CDS区全长,重组质粒构建成功;荧光检测表明,成功建立表达Sox2基因的绵羊BMSC系。本研究得到了高表达Sox2基因的绵羊BMSC系,为提高体细胞克隆过程中的重编程效率提供了新思路。

绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测

为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。

猪早期胚胎发育中SOX2基因启动子活性分析

转录因子SOX2(sex determining region Y-box2)在早期胚胎发育第一次谱系分化以及内细胞团多能性维持等方面具有重要的作用。但是目前有关SOX2基因启动子的系统研究较少,尤其是在猪(Sus scrofa)中尚无相关报道。为系统分析猪SOX2基因启动子在早期胚胎中的活性,本研究通过优化显微注射体系中绿色荧光蛋白表达载体种类和注射时间,构建了适合猪SOX2基因启动子活性分析的参照体系和显微注射体系;对猪SOX2基因翻译起始位点上游5000 bp区域进行转录因子结合位点的预测,发现该区域存在4个转录因子结合位点簇;针对上述区域设计并构建相应的缺失型SOX2基因启动子报告载体,利用建立的显微注射体系将其导入胚胎,通过mCherry荧光强度以及qRT-PCR定量分析SOX2基因启动子中不同转录因子结合位点簇对启动子活性的影响。结果表明,与全长SOX2基因启动子相比,SOX2基因翻译起始位点上游2254~2442 bp区域缺失后,猪4-细胞和8-细胞胚胎中SOX2基因启动子活性下降至17.8%,该缺失区域中仅包含两个NF-AT(nuclear factor of activated T cells)转录因子结合位点。因此,本研究结果推测猪SOX2基因启动子中NF-AT转录因子结合位点是影响猪早期胚胎SOX2基因启动子活性的关键位点。本研究为揭示猪早期胚胎发育中SOX2基因表达调控机制提供了数据支持。

中国汉族人群SOX2基因与高度近视的关联研究

目的研究SOX2是否可作为中国汉族人群高度近视的候选基因,寻找与高度近视关联的致病基因位点。方法采用病例-对照关联分析法。将同意参加本研究的83例(160眼)正视者作为对照组,117例(211眼)高度近视患者作为病例组,所有患者均进行详细的眼部检查,并提取外周血白细胞基因组DNA。在中国汉族北京居民的基因型数据库中选取3个标签单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,采用SNP直接测序法进行基因分型检测。根据所有样本所得各标签SNP的基因型,计算其基因型和等位基因频率,并使用Bonferroni法进行多重检验矫正;采用χ2检验比较病例组和对照组之间等位基因频率及基因型频率分布是否有差异。结果3个标签SNP位点(rs11915160、rs4575941、rs4459940)的基因型结果在病例组和对照组中都符合Hardy-Weinberg平衡,本研究人群具有一定的代表性。rs4575941位点的基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组间的差异均具有统计学意义(P=0.04、0.03),但经Bonferroni法矫正后,两组等位基因频率差异无统计学意义(Pc=0.09);病例组rs4575941位点的等位基因G的频率明显高于对照组,OR值为1.58,等位基因G可能是高度近视的一个危险基因。结论中国汉族人群SOX2基因SNP位点rs4575941与高度近视之间的关联存在可疑性,为了明确相关性,需要进一步扩大样本量,选择合适的多重检验方法,并结合其他手段进行大数据分析。

双酚A对小鼠胚胎干细胞OCT4及SOX2基因表达的影响

目的探讨双酚A（bisphenolA，BPA）对小鼠胚胎干细胞（mESC）的毒性特征及OCT4、SOX2基因表达的影响。方法分别以10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／L浓度的BPA及二甲亚砜（溶剂对照组，DMSO）处理mESC系（S6）细胞24h，重复处理3次，倒置显微镜下观察正常组、染毒组细胞的形态变化，CCK-8法检测BPA对细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度（IC50）；分别采用real—time（RT）一Q—PCR和western—blotting技术检测BPA作用下OCTg、SOX2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果BPA对mESC有一定的毒性作用，染毒浓度越大，细胞活性越小，二者呈剂量-效应关系，并通过计算得出BPA对mESC的IC50为4．3×10^-4mol／L，同时结合BPA的环境相关暴露浓度和相关资料，最终取10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／L系列浓度作为后续实验浓度；BPA处理24h后，mESC细胞形态发生改变，较高浓度组与对照组比较，细胞数量明显减少，出现少许漂浮的细胞，克隆变得不规则，分化趋势明显。BPA浓度为10^-7、10^-6、10^-5、10^-4的OCT4mRNA相对表达量分别为1．146±0．087、1．156±0．030、1．158±0．103、1．374±0．053，均高于对照组（1．000±0．000）（t值分别为-2．384、-2．953、-3．203、-4．021，P值均〈0．05）；BPA染毒浓度为10^-4mol／L（1．113±0．052）的SOX2mRNA相对表达水平高于对照组（1．000±0．000）（t=-2．765，P〈0．05）。染毒浓度为10^-5、10^-4mol／L的OCT4蛋白质相对表达量分别为1．360±0．168、1．602±0．151，均高于DMSO组（1．0004-0．000），差异有统计学意义（t值分别为-3．538、-4．002，P值均〈0．05）；而各浓度组SOX2蛋白相对表达水平差异无统计学意义。结论BPA对mESC具有一定的细胞毒性，在一定剂量范围内BPA可以使mESCOCT4基因表达增加，而对SOX2基因无明显影响。

牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession No.NM-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。

水牛Sox2基因原核表达载体的构建与诱导表达

水牛Sox2基因对体内胚胎的早期发育至关重要,它是重要的多能性干细胞(iPS细胞)标记基因之一,试验通过双酶切重组质粒pMD18-T-Sox2,将水牛Sox2基因定向克隆入原核载体pET-32a(+),成功构建了原核表达载体pET-Sox2,然后利用IPTG诱导,获得诱导表达蛋白,并经过SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:诱导表达蛋白为特异性Sox2蛋白。

绵羊成纤维细胞及精子Sox2基因启动子甲基化状态检测

为了探明绵羊成纤维细胞及精子中Sox2基因启动子甲基化状态的差异,试验对绵羊Sox2基因启动子进行序列查询和甲基化岛分析,提取绵羊成纤维细胞和精子基因组,用重亚硫酸盐处理,进行甲基化特异性PCR、连接和酶切鉴定,最终分别随机选取10个测序结果进行甲基化状态分析,比较二者的甲基化状态。结果表明:在精子的350个甲基化位点中,有194个位点处于非甲基化状态,156个位点处于甲基化状态,甲基化率为44.6%;在成纤维细胞的350个甲基化位点中,93个位点处于非甲基化状态,257个位点处于甲基化状态,甲基化率为73.4%;χ~2检验表明二者的甲基化状态差异极显著(P<0.01)。说明绵羊精子和成纤维细胞的Sox2基因启动子区域甲基化状态存在较大差异。

应用引物原位标记技术快速检测SOX2基因

目的应用引物原位标记（primedin situ labeling，PRINS）代替荧光原位杂交技术对SOX2基因进行快速检测。方法常规制备人外周血染色体并制片，利用SOX2基因特异性引物在染色体上原位扩增包含生物素标记的探针。用酪胺信号放大（tyramidesignalamplification，TSA）生物素系统处理经标记的探针。最后用链霉亲和素-德克萨斯红（streptavidin-Texasred）对生物素信号进行荧光染色，用DAPI染料对染色体进行复染。作为对照，MCF-10F细胞用慢病毒载体转染导入SOX2基因，使用相同的方法检测结合位点。结果VideoTesT—FISH软件分析提示，实验组3号染色体长臂端有特异红色荧光信号表达，空白组与未经TSA信号处理的对照组则无特异性的红色荧光信号。经过转染的MCF-10F细胞则表现出不同的SOX2基因整合效果。结论PRINS技术利用高敏感度的原位PCR技术（insituPCR）结合荧光标记的脱氧核苷酸可在细胞内原位合成形成探针，可大大减少探针的费用与检测的时间，提高检测效率。在诱导多能干细胞的鉴定与分类中具有较为广泛的应用前景。

宫颈癌组织中Sox-2的表达变化及意义

目的观察宫颈鳞癌组织中转录因子Sox-2的表达变化,并探讨其临床意义。方法采用免疫组化法检测84例宫颈鳞癌组织、66例宫颈CIN组织、22例正常宫颈组织中的Sox-2蛋白,采用RT-PCR法测定Sox-2 mRNA。结果宫颈癌组织、CIN组织及正常宫颈组织中Sox-2蛋白表达阳性率分别为85.71%(72/84)、36.36%(24/66)、0.18%(4/22),三者相比,P均<0.01;Sox-2 mRNA的相对表达量分别为0.877±0.208、0.463±0.093、0.243±0.023,三者相比,P均<0.01。Sox-2蛋白表达与宫颈癌淋巴结转移、临床分期、分化程度有关(P均<0.05)。Sox-2 mRNA的表达随着宫颈癌病理学分级的上升而升高。结论宫颈癌组织中Sox-2蛋白及其mRNA表达明显上调,其可能参与了宫颈癌的发生发展,并与肿瘤细胞浸润与转移有关。

干细胞转录因子Sox2、Oct4在肺癌组织中表达及与肿瘤微淋巴管的关系

目的观察干细胞转录因子Sox2、Oct4在肺癌组织中的表达变化,并探讨二者与肿瘤微淋巴管的关系。方法用免疫组化法检测60例肺癌组织及其相应正常肺组织中Sox2、Oct4蛋白表达、D-240标记的微淋巴管密度(LMVD)。结果肺癌组织中Sox2、Oct4蛋白阳性表达率、LMVD与正常肺组织比较,P均<0.05。Sox2、Oct4蛋白阳性表达及LMVD均与肿瘤分化程度、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移、肝转移有关(P均<0.05),此外Sox2、Oct4蛋白阳性表达还与肿瘤病理类型有关(P均<0.05)。肺癌组织中Sox2、Oct4蛋白阳性表达者LMVD与阴性者比较,P均<0.05。结论 Sox2、Oct4在肺癌组织中呈现高表达,二者可能共同参与了肺癌组织微淋巴管的生成、浸润及淋巴道转移。

转录因子Sox2的研究进展

转录因子Sox2是sox基因家族的一个成员,由于它在早期胚胎发生、神经分化和晶状体发育等多种重要的发育事件中都起着关键的作用,从而引起了越来越广泛的关注。本文就小鼠sox2基因的研究进展作一综述。