过表达SOX6基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨过表达SOX6基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡的影响及其机制。方法将体外培养的卵巢癌SKOV3细胞随机分为两组,通过特异性重组质粒pc DNA3.1-SOX6转染建立稳定过表达SOX6基因的SKOV3细胞作为实验组,空载体pc-DNA3.1-mock转染的SKOV3细胞作为对照组。采用酶标仪测定两组450 nm波长处的光密度(OD)值作为细胞活性指标,采用Edu荧光染色法检测两组细胞增殖率,采用Hoechst33342细胞染色法检测细胞凋亡率,采用Western blotting法检测PTEN、蛋白激酶B(Akt)及p-Akt蛋白表达。结果实验组及对照组OD450值分别为2.1±0.1、4.3±0.5,细胞增殖率分别为(13.2±2.2)%、(43.3±4.2)%,细胞凋亡率分别为(15.2±3.2)%、(5.2±1.4)%,组间比较P均<0.05。与对照组比较,实验组PTEN蛋白表达升高,p-Akt蛋白表达降低,组间比较P均<0.05。两组Akt蛋白表达比较P>0.05。结论过表达SOX6基因能够抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡;其机制可能是抑制PTEN/Akt信号通路激活。

骨质疏松易感SNP rs4325274通过增强子远程调控SOX6基因的功能机制研究

骨质疏松症是一种典型的多基因复杂疾病,遗传力高达85%,其发病率已跃居常见疾病的第5位。尽管已经鉴定出大量骨质疏松易感SNP,但大多数SNP位点位于基因组非编码区,且功能机制未知。本研究旨在通过生物信息学分析和功能实验探究骨质疏松非编码功能性易感SNP rs4325274的分子调控机制。首先,通过表观注释发现该SNP所在区域处在增强子上,eQTL和Hi-C分析结果发现SNP调控的潜在靶基因是SOX6;然后,利用多种数据库进行Motif预测,并结合GEO数据库中的ChIP-seq数据分析进行了验证,结果发现转录因子HNF1A更倾向于结合SNP rs4325274-G碱基;进一步通过双荧光素酶报告基因实验验证了该SNP对SOX6基因表达的增强作用;最后,利用shRNA敲低转录因子HNF1A实验,检测靶基因SOX6的表达变化。以上研究结果初步解析了非编码区功能性SNPrs4325274作为增强子远程调控SOX6基因表达的分子机制,为复杂疾病非编码易感SNP的遗传调控研究提供新思路。

SOX6基因对H2O2诱导的星形胶质细胞损伤的机制

目的探讨干扰SOX6基因表达对H2O2诱导的星形胶质细胞(AS)凋亡、线粒体膜电位及PI3K/AKT信号通路影响。方法从乳大鼠大脑皮质分离培养AS细胞,将细胞分为阴性对照组(NC组):AS转染无干扰作用的siRNA;H2O2组:20μmol/L的H2O2处理AS细胞24 h;H2O2+NC组:无干扰作用的siRNA转染AS细胞24h后,20μmol/L的H2O2处理细胞24 h;H2O2+si-SOX6组:SOX6特异性siRNA转染AS细胞24 h后,20μmol/L的H2O2处理细胞24 h。通过LDH试剂盒、流式细胞术及JC-1探针分别检测细胞毒性、凋亡率及线粒体膜电位;Western blotting检测SOX6、Cyt.C、caspase3、caspase9、Bcl-2、Bax和p-AKT蛋白表达。结果H2O2可明显上调AS细胞SOX6、Cyt.C、caspase3、caspase9和Bax表达,下调Bcl-2和p-AKT表达,提高细胞毒性,诱导细胞凋亡,而干扰SOX6基因表达可明显减弱H2O2对细胞SOX6、Cyt.C、caspase3、caspase9、Bcl-2、Bax和p-AKT表达及细胞毒性和凋亡影响。结论干扰SOX6基因表达可通过抗凋亡途径保护H2O2诱导的AS损伤,此保护作用与线粒体通路及PI3K/AKT信号通化激活有关。

Sox6基因调控鸡骨骼肌分化和肌纤维类型的研究

本实验室前期研究发现一个拷贝数变异区域与鸡的重要经济性状显著相关,并且该区域与Sox6编码区域重叠,提示Sox6基因对骨骼肌生长发育具有调控作用。研究首先采用RTqPCR分析Sox6基因在不同胚龄隐性白母鸡的胸肌和腿肌中的表达情况和表达差异。接着在原代成肌细胞中过表达Sox6基因,通过RT-qPCR、免疫荧光和HE染色观察Sox6对原代成肌细胞的肌纤维类型调控情况和分化的影响。结果表明,Sox6 mRNA表达量在不同胚龄的胸肌和腿肌上的表达趋势相近,但在胸肌上的表达量高于腿肌,并且在E14、E17和7W时,胸肌表达量显著高于腿肌(P<0.05),提示Sox6可能对快肌起到重要作用。原代成肌细胞上面过表达Sox6后定量快慢肌特异基因发现Sox6能够促进MyH1B,抑制sMyHC1的表达;免疫荧光和HE染色观察发现Sox6能够促进成肌细胞的分化和肌管的形成,从而证明了Sox6对骨骼肌的分化和肌纤维类型调控具有一定的作用。

夏南牛SOX6基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆夏南牛SRY-box转录因子6(SRY-box transcription factor 6,SOX6)基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究SOX 6基因在不同月龄夏南牛不同组织及牛原代骨骼肌细胞分化过程中的表达规律。【方法】以夏南牛腿肌组织cDNA为模板,PCR扩增SOX 6基因CDS区序列,与其他物种进行相似性比对及系统进化树构建,运用在线软件对SOX6蛋白进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR方法分别检测SOX 6基因在夏南牛犊牛(0月龄)、青年牛(12月龄)和成年牛(24月龄)不同组织以及牛原代骨骼肌细胞不同分化时期的表达情况。【结果】夏南牛SOX 6基因CDS区序列全长2526 bp,编码841个氨基酸。系统进化树结果表明,夏南牛与牦牛亲缘关系最近,与鸡亲缘关系最远。SOX6蛋白为弱碱性、亲水性蛋白,分子质量为93.35 ku,定位于细胞核中,不含跨膜结构与信号肽。SOX6蛋白二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成,占比分别为41.26%、45.54%、8.09%和5.11%。蛋白互作分析表明,SOX6蛋白与Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、软骨蛋白聚糖(ACAN)、羧基端结合蛋白2(CTBP2)和叉头框J3(FOXJ3)等蛋白间存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,夏南牛SOX 6基因在不同月龄夏南牛腿肌组织中相对表达量均最高,在脾脏中表达量最低;在12月龄腿肌组织中表达量显著高于0、24月龄(P<0.05)。随牛原代骨骼肌细胞分化,SOX 6基因表达量逐渐升高,第6天时SOX 6基因表达量显著高于0、2、4和8 d(P<0.05)。【结论】本研究成功克隆了夏南牛SOX 6基因CDS序列,其编码蛋白为不稳定、弱碱性、亲水性蛋白,在不同月龄腿肌组织中表达量均显著高于其他组织,分化6 d牛原代骨骼肌细胞中表达量显著高于其他时期。本试验结果为进一步研究SOX 6基因在夏南牛肌肉发育过程中的调控作用提供理论依据。

Sox6基因和Col2a1在大鼠bMSCs体外成软骨分化中表达及其意义

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)成软骨分化中Sox6基因和Ⅱ型胶原α1(Col2α1)表达水平的变化及其意义。方法 2个月龄SD大鼠分离bMSCs,置含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基中培养。传至第3代后,细胞分为诱导组和未诱导组,诱导组在培养基中添加含转化生长因子β1(TGF-β1)的诱导剂,分别在诱导后3、6、12、24h、3、7和14d提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,荧光定量PCR法检测Sox6基因和Col2α1基因的表达。同时应用细胞免疫化学法检测诱导14d的Col2α1的表达。结果与未诱导组细胞比较,bMSCs在TGF-β1的诱导下,形态上发生软骨样细胞变化;诱导后6h,Sox6基因的表达上升6.3倍(P<0.01),随后迅速下降,3-14d维持在4.0-4.7倍水平;Col2α1基因的表达量在诱导后3d达1.9倍,7d和14d分别达14.3和35.8倍(P<0.01)。诱导组可见大量Ⅱ型胶原阳性细胞。结论 bMSCs在体外可以分化为软骨样细胞,Sox6基因在bMSCs的成软骨分化的早期和晚期都发挥了一定的作用。

miR-422a通过调控SOX6抑制H2O2对PC12细胞的损伤

目的:研究微小RNA-422a(miR-422a)靶向调控人性别决定区Y框6(SOX6)对过氧化氢(H 2O 2)刺激下大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12(具有神经细胞特性)损伤的作用。方法:采用real-time PCR检测H 2O 2处理后PC12细胞中miR-422a表达的变化,在PC12细胞中转染miR-422a mimics,MTT法测定细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,流式细胞术测定细胞凋亡水平。靶基因预测软件预测SOX6可能是miR-422a的靶基因,萤光素酶报告基因实验鉴定靶向关系。在PC12细胞中共转染miR-422a mimics和SOX6过表达载体,检测过表达SOX6对miR-422a mimics调控H 2O 2条件下PC12细胞活力、LDH漏出率和凋亡的影响。结果:H 2O 2处理后PC12细胞中miR-422a表达水平降低(P<0.05)。H 2O 2处理后的PC12细胞的活力降低,LDH漏出率和细胞凋亡率升高(P<0.05)。miR-422a mimics能够提高H 2O 2条件下PC12细胞活力,降低LDH漏出率和凋亡率(P<0.05)。miR-422a靶向负调控SOX6表达。SOX6过表达载体可以逆转miR-422a对PC12细胞活力提高和LDH漏出率、细胞凋亡率降低的作用(P<0.05)。结论:miR-422a通过靶向抑制SOX6可降低H 2O 2对PC12细胞的损伤作用。

MiR-96靶向调控Sox6促进小鼠β细胞胰岛素合成与分泌

目的探索miR-96对小鼠胰岛β细胞胰岛素合成与分泌的影响及其作用机制。方法将小鼠胰岛β细胞系(MIN6细胞)分为四组,通过脂质体LipfectamineTM2000介导将miR-96 mimics、mimicsNC、miR-96 inhibitor、inhibitor NC瞬时转染至4组细胞,荧光定量PCR和ELISA方法分别检测Ins1、Ins2mRNA的表达及细胞上清液中的胰岛素浓度,生物信息学分析miR-96与Sox6 3UTR的结合关系,荧光素酶报告基因检测miR-96与Sox6的结合情况,Western blot检测Sox6蛋白水平。结果与对照组比较,miR-96 mimics能增加葡萄糖刺激下MIN6细胞胰岛素的合成与分泌(P <0.01),而miR-96 inhibitor可下调胰岛素的合成与分泌(P <0.01)。miR-96与Sox6 3UTR的553-561位点结合。过表达miR-96可显著抑制Sox6荧光素酶活性及MIN6细胞中Sox6蛋白的表达。结论 miR-96靶向沉默Sox6进而促进β细胞胰岛素的合成与分泌。

SoxD家族基因与肿瘤发生发展关系的研究进展

Sox基因家族是一类具有高度保守序列的转录因子编码基因,其D亚族中主要成员Sox5和Sox6参与调控胚胎发育、神经生长、软骨形成等生长发育过程。近年来关于SoxD亚族与肿瘤的研究逐渐增多,显示SoxD亚族在不同肿瘤类型中发挥着促癌或抑癌的作用;同时D家族成员的表达差异还可以用于鉴别诊断或作为肿瘤预后的分子标记物。本文介绍SoxD亚族中Sox5和Sox6基因结构及功能,并重点阐述两者在肿瘤发生发展中的意义及相关研究进展。

miR-1269a在食管癌组织中的表达及其对KYSE30细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨miR-1269a在食管癌组织中的表达及其对KYSE30细胞恶性生物学行为的影响,并研究其可能的作用机制。方法:选取90例在河北医科大学第四医院通过手术切除的食管癌组织标本,并收集正常食管永生化上皮细胞和食管癌细胞系,应用qPCR实验检测癌组织和细胞系miR-1269a的表达水平。将miR-1269a的mimics和inhibitor分别转染食管癌细胞KYSE30后,用MTS、Transwell和克隆形成实验分别检测miR-1269a对KYSE30细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的影响。通过生物信息学软件预测miR-1269a的靶基因,并通过WB实验和双荧光素酶报告基因实验验证miR-1269a对靶基因的调控作用。转染SOX6质粒后,采用MTS、Transwell和克隆形成实验分别检测SOX6对KYSE30细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力的影响,并利用回复实验进一步验证结果。结果:食管癌组织中miR-1269a的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05);与正常食管上皮细胞相比,食管癌细胞系中miR-1269a的表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。miR-1269a mimics转染组KYSE30细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力显著高于mimics NC组(P<0.05或P<0.01);inhibitor转染组KYSE30细胞的增殖、侵袭、迁移和克隆形成能力显著低于inhibitor NC组(P<0.05或P<0.01)。miR-1269a可与SOX6的3’UTR区相结合,且过表达miR-1269a后,KYSE30细胞的SOX6表达水平和荧光素酶报告基因的活性均显著降低(P<0.05)。回复实验表明,高表达miR-1269a可以促进食管癌细胞增殖、侵袭和迁移(P<0.05或P<0.01),同时高表达SOX6后,miR-1269a的促进作用出现部分逆转。结论:miR-1269a在食管癌组织和细胞系中表达上调,能够促进KYSE30细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成等恶性生物学行为,其机制可能是通过抑制靶基因SOX6实现的。

pcDNA3.1(+)-SOX6真核表达载体构建及在KYSE-30细胞的表达

目的构建人性别决定区Y盒6(SOX6)基因真核表达载体并观察其在KYSE30细胞内的表达。方法将人SOX6c DNA克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,经酶切和测序证实后,以Lipofectamine2000介导转染KYSE30细胞,应用RT-PCR和western blot鉴定SOX6在细胞内的表达。结果 SOX6 c DNA为2358bp的片段,重组质粒pc DNA3.1(+)-SOX6经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后产生的2400bp和5400bp的片段,DNA测序证实酶切产生的2400bp片段的碱基序列与人类SOX6 c DNA完全一致。将其转染至KYSE30后,RT-PCR和western blot的结果显示SOX6能在真核细胞中正确表达。结论成功的构建了pc DNA3.1(+)-SOX6重组质粒,为后续的研究奠定基础。