Identification of QTL and Analysis QTL with Tolerance to Sclerotinia sclerotiorum in Soybean

Soybean white mold(SWM) caused by Sclerotinia sclerotiorum is a serious disease of soybean and other plant, which is mainly distributed in the soybean producing areas of north China, east China, southwest and northeast China. The tolerance of soybean to sclerotium is partial resistance(quantitative trait), which is controlled by multiple genes. Mapping QTL and identifying candidate genes underlying soybean tolerance to SWM can accelerate the process of breeding for disease-resistant varieties. In the present study, a total of 128 lines derived from the susceptible soybean cultivar Hefeng25 and the disease tolerant soybean cultivar Maple Arrow were evaluated by in vitro and in vivo inoculation methods. A total of 78 SSR markers were used to construct linkage groups(D1 a(Chr.01), A2(Chr.08), B1(Chr.11) and F(Chr.13)) which intensively distributed SWM resistance related QTLs. Five QTLs were detected through combining two sets of phenotypic data with the composite interval mapping(CIM) method. A total of seven candidate genes located in the five QTLs were induced by Sclerotinia sclerotiorum. The SSR markers and candidate genes associated with tolerance to Sclerotinia sclerotiorum could be helpful for SWM resistance breeding in soybean.

紫外光对菌核(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)萌发和子囊盘形成速度的影响

本文研究了紫外光对大豆菌核(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)萌发和子囊盘形成速度及成熟的影响。试验结果表明,大豆菌核经紫外线照射后,不仅能促进菌核萌发,增加展开子囊盘的百分率,而且还能增加子囊盘的数目。用紫外线照射大豆菌核,照射时间范围10～150分钟,对菌核无伤害作用,菌核仍能正常地长出子囊盘。

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)在大豆叶片上致病过程的初步电镜观察

通过电子显微镜观察核盘菌在大豆叶片上的侵染过程,初步发现该病菌首先在大豆叶表面上形成复合附着器。该附着器可能产生某些酶类软化溶解大豆叶表面,以帮助该病菌侵入叶片内。侵入叶片以后,该病菌既能在叶肉细胞间又能在叶肉细胞内生长。在此过程中,该菌仍借助于酶的分解作用破坏寄主组织,直至再突破叶面角质层,出现在叶面上。然后该菌在叶面上形成菌核。在大豆不同生育期,该病原侵染寄主大豆的速度有所不同。苗期最快,花期最慢。

实验室自繁大豆菌核萌发影响因素研究

采用人工繁育菌核进行萌发试验,研究人工繁育菌核与自然菌核萌发区别及培养时间、形成菌核的菌龄和保存方式对菌核萌发的影响。结果表明,PDA平板培养菌核萌发时间较少,采集菌核萌发时间最长及萌发率最低;PDA平板15 d形成菌核萌发时间短,培养30和45 d菌核萌发时间无明显差异;不同菌龄形成菌核萌发无差异;繁育菌核直接培养萌发时间最短,干燥储存时间越长,后续萌发培养时间越长。

连作和轮作大豆菌核病发生情况调查

菌核病为大豆连作的主要病害之一,连作大豆花期易感染。文章以喜海3号为试验材料,对连作和轮作地块大豆菌核病发生情况进行调查。结果表明,连作大豆感染菌核病后株高、节数、有效荚数、百粒重和产量降低,无效荚数增多。其中株高与节数分别下降12.5%和10.6%,大豆减产36.0%,百粒重降低9.8%,有效荚数减少34.5%,无效荚数增加844.8%。连作地块菌核病平均发病率为45.2%,轮作地块未感染大豆菌核病。连作条件下大豆感染菌核病几率增加,减产严重,在生产中应避免大豆连作且应对染病地块进行有效防治,减少对大豆产量影响。

栽培大豆种质资源对大豆菌核病的抗性评价

采用离体叶柄接种法鉴定了200份栽培大豆高世代品系对大豆菌核病菌株Jia30和Jian29的抗感反应。结果表明:在所有的参鉴材料中没有发现免疫类型,但各品系间抗性有一定的差异。供试200个品系中既表现抗Jia30菌株又表现抗Jian29菌株的材料占供试材料的2%;抗Jia30菌株的材料占3%;抗Jian29菌株的材料占5%,根据抗性资源筛选结果,这些抗性材料可合理地用于大豆生产,并为大豆抗病育种亲本选择和利用品种布局进行大豆菌核病生态控制提供了依据。

大豆品种Maple Arrow耐菌核病生化机制

以世界公认的菌核病抗性品种Maple Arrow以及感病品种合丰25为材料,在大豆V1期进行活体接种,比较不同抗感材料在接种核盘菌后的72h内6个时间点的菌丝扩展速度和4种生化酶活性,旨在明确MapleArrow抗菌核病的生化机制,为抗病育种提供依据.扫描电镜结果表明,抗感品种在侵染后0～72h对病原菌的抗性差异明显,接种前期病原菌在Maple Arrow叶片上的扩展速度明显低于合丰25.接种后期,Maple Arrow叶片病健交界明显,菌丝体周围寄主组织结构保持相对完整;合丰25叶片布满菌丝体,叶片结构崩溃.动态生化指标测定结果表明抗感品种在过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均不同程度的高于对照组.接种后24h Maple Arrow的PPO活性显著高于感病品种;接种后48h Maple Arrow的POD和PAL的活性增加幅度显著高于合丰25.由此得出结论,抗病品种Maple Arrow的保护酶系统对核盘菌侵染的响应比感病品种合丰25更为活跃,四种保护酶中的PPO、POD和PAL是两种抗性差异的关键因子,其中PPO主要作用于感染前期,POD和PAL主要作用于后期.

东北黑土区核盘菌对大豆寄主的破坏性研究

大豆菌核病已成为我国大豆产区的主要病害之一，而且对大豆产量和品质性状的影响愈来愈大。为揭示不同大豆品种受到核盘菌侵染后植株形态，籽粒产量和品质的变化，收集黑土区不同地点核盘菌菌核进行分离，观察病原菌对大豆寄主形态学危害性，分析其对寄主品质性状的影响。结果表明：不同地区菌核分离物其形态特征是不同的；病原菌首先侵染大豆子叶产生白色菌丝，进而侵染大豆叶片、茎秆、荚，最终在茎秆内、荚中形成菌核。大豆寄主受到核盘菌病原侵染后，百粒重下降9．9％～20．8％，脂肪、蛋白质含量分别下降0．95％-1．81％和0．17％-1．12％，氨基酸总量下降0．59％-4．98％。3个大豆品种中17种氨基酸含量变化是垦鉴4号氨基酸均有下降趋势；哈97-124品系只有一种氨基酸含量没有下降（组氨酸）；黑农35则有5种氨基酸（组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸）含量没有下降。

大豆菌核病拮抗菌株的筛选

大豆菌核病是大豆的主要病害之一,对大豆生产造成极大危害。目前主要采用化学药剂进行防治,对环境、人畜不安全。本试验从生物防治角度解决此问题。试验采用土壤诱捕法、菌核内生菌分离法及土壤稀释平板分离法获得对大豆菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)有拮抗作用的菌株共15株,其中以"克H3"菌株对菌核菌的拮抗作用最强,平皿对峙培养时抑菌圈直径可达11.4 cm。同时对"克H3"菌株的形态、性状进行了初步研究。

大豆菌核病鉴定方法研究进展

大豆菌核病在全球范围内均有发生,由于病原菌寄主范围较广,难于防治,对大豆产量和品质产生严重影响。对于大豆菌核病抗性种质资源的鉴定是抗性机理研究、基因定位及抗病育种工作的重要基础,文章对大豆菌核病资源鉴定中涉及的接种体(菌丝、孢子和菌核)的培养、植株不同部位的接种鉴定、草酸鉴定、茎中可溶性色素水平测定及田间鉴定方法进行了系统的总结和分析,并针对接种体的选择、环境条件对发病的影响及田间与温室鉴定结果不一致等问题展开讨论,为大豆菌核病抗性资源的筛选,菌核病发病机理及抗性基因的定位研究奠定基础。

黑龙江省大豆菌核病菌生长特性及菌丝体亲和型测定

对来自黑龙江省伊春、绥化、鹤岗和佳木斯地区的88个大豆菌核病菌分离物进行了生长特性和菌丝体亲和型研究。结果表明,4个地区的分离物菌落形态、菌丝生长速率、菌核产生位置、菌核数量及重量均有差异。88个分离物按菌落特征分为5型,每种菌落形态分离物之间在菌丝生长速率、菌核数量及重量方面也存在显著差异。菌丝体亲和型测定表明,88个分离物共分为29个菌丝体亲和群(MCG),其中24个(82.8%)亲和群由自身亲和的单个分离物组成,最大的亲和群由来自绥化、鹤岗和佳木斯地区的43个分离物组成。同一亲和群内分离物的生物学特性也不一致。表明黑龙江省大豆菌核病菌具有较丰富的多样性和遗传异质性。

大豆抗菌核病研究进展

大豆菌核病是导致大豆严重减产的第二大病害,近十几年在我国尤其是东北的黑龙江和吉林大豆主产区发病日趋严重。综述大豆抗菌核病遗传育种领域的相关研究,即抗性鉴定方法、抗病种质资源、抗性遗传与QTL和抗性基因工程等4方面的研究进展,并提出了目前大豆抗菌核病遗传育种研究存在的关键性问题及可能的解决方法。

大豆菌核病菌生物学特性的研究

为有效控制大豆菌核病的发生、蔓延,从采自黑龙江省不同地区大豆菌核病菌中选取5个代表性菌株进行生物学特性的研究。结果表明:大豆菌核病菌菌丝生长的最适温度为20～25℃,而菌核在15～20℃时产生量最多;菌丝适于在中性和偏酸性条件下生长。病菌在PDA和大豆叶片汁培养基上生长较好,菌核的产生则在向日葵叶片汁培养基上最多;有无光照对菌丝生长影响不大,但光照有利于菌核的产生。子囊孢子萌发最适温度为25℃;萌发最适pH为7～8;大豆汁、向日葵汁和油菜汁可促进子囊孢子的萌发;有无光照对子囊孢子萌发无显著影响。不同地区大豆菌核病菌由于生态条件的不同,菌核萌发形成子囊盘能力和病原菌的致病力也存在差异。

大豆菌核病田间快速接种鉴定方法研究

【目的】在大田环境下建立快速有效的大豆菌核病田间接种鉴定方法,为大豆抗菌核病育种服务。【方法】采用收集不同地区和寄主来源的菌核病分离物,经PDA培养基再生培养,再接种麦粒形成麦粒接种体,利用微创结合锡箔纸捆绑麦粒接种体的方法建立大豆菌核病田间接种鉴定方法。【结果】不同大豆种质间的病情指数和病斑长度存在显著差异,不同分离物间的病情指数和病斑长度也存在显著差异,而重复间的病情指数和病斑长度差异不显著,病斑长度与病情指数呈极显著正相关(r=0.8301,P<0.0001)。【结论】该大豆菌核病田间接种鉴定方法能够有效地对大豆菌核病分离物的致病性和大豆植株抗性进行鉴定和筛选,可用于大豆抗菌核病育种。

大豆品种抗病虫性评价及多抗性抗源筛选

通过人工接菌和田间自然鉴定的方法,对大豆食心虫、大豆蚜和大豆菌核病进行了品种抗性鉴定。从92个品种和品系中,鉴定出高抗大豆食心虫6个,抗16个,中抗36个,感虫34个。从112个品种(系)中,鉴定出高抗大豆菌核病1个,抗12个,中抗17个,感57个,高感25个。从34个初选品种(系)中,鉴定出中抗大豆蚜12个,感22个。综合选出抗2虫1病、抗倒伏及高产的多抗品种6个。

转盾壳霉Cmoxdc1基因增强大豆对菌核病抗性的研究

草酸被认为是核盘菌的主要致病因子,在病原菌的侵染过程中发挥着重要作用,并与核盘菌的致病力密切相关,为研究转盾壳霉草酸脱酸酶基因Cmoxdc1对大豆菌核病抗性的促进作用,本研究利用农杆菌介导转化法,将来源于核盘菌生防菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)的Cmoxdc1基因导入大豆感病品种Jack,研究转Cmoxdc1基因大豆对草酸耐受性和菌核病抗性。结果表明:外源基因以低拷贝形式(1~2个)整合至大豆基因组,并能够完成转录。对离体叶片进行60 mmol·L^-1草酸处理后,转基因植株叶片病斑面积显著低于对照受体品种,接种7 d后病斑面积较受体对照减少88.80%~89.98%。离体叶柄和叶片接种核盘菌后,转基因大豆病斑扩展受到明显抑制,病斑长度和病斑面积均显著低于对照受体。接种4 h后,叶柄病斑长度为对照品种的41.38%~43.51%;接种7 d后,叶片病斑面积为对照品种的8.68%~27.01%;并且,接种核盘菌后转基因叶片中的草酸含量也较对照品种显著降低。研究结果表明盾壳霉Cmoxdc1表达显著增强转基因大豆对草酸的耐受性和对菌核病的抗性。

大豆新品种(系)的菌核病耐病性鉴定

采用茎中可溶性色素水平测定法,对来自不同省份的95份大豆新品种(系)菌核病耐病性进行了鉴定。结果表明:参试大豆品种(系)对大豆菌核病耐病性存在着一定的差异。共有11份大豆品种(系)表现为中等耐病性,占参试材料的11.58%,其中4份耐病强度(TI)﹥60%;11份中等耐性品种(系)中有8份来自东北地区,占所有中耐材料的72.73%,表明在东北地区大豆菌核病耐病性资源较丰富。

大豆菌核病菌生长特性及抗药性初步测定

采用单菌核分离法得到大豆菌核病菌,利用菌丝生长速率法测定了7株大豆菌核病菌的生物学特性及对多菌灵和腐霉利的抗药性。结果表明：供试菌株菌丝生长的最适温度是15-20℃,而菌核的产生则在15℃左右最多;大豆菌核病菌丝生长最适的环境为中性和偏酸性;不同菌核及病残体埋入土壤不同深度后越冬处理,病残体上菌丝不能越冬,而菌核能够越冬,且埋入土层越深菌丝生长速度越慢,产生菌核的重量也降低;大豆菌核病菌对茄子、向日葵、油菜、大豆的致病力存在差异,H6菌株致病力最强;多菌灵对不同地理区域的菌株的EC50为0.5022-0.3525μg·mL^-1,但均小于1μg·mL^-1,其中最不敏感菌株EC50为最敏感菌株EC50的1.42倍,均为敏感菌株;腐霉利对不同地理区域的菌株的EC50为1.0230-0.4388μg·mL^-1,但均小于10μg·mL^-1,其中最不敏感菌株EC50为最敏感菌株EC50的2.33倍,均为敏感类型。尚未发现对多菌灵和腐霉利具有抗药性的菌株。

大豆GmGLP10基因的克隆及生物信息学分析

通过PCR的方法从大豆抗菌核病品种Maple Arrow中克隆得到Gm GLP10基因,生物信息学分析结果显示Gm GLP10蛋白由213个氨基酸组成,具有一个糖基化位点和多个磷酸化位点,为胞外分泌蛋白。通过对Gm GLP10基因起始密码子上游1 500 bp序列进行顺式作用元件分析,预测Gm GLP10启动子上具有多个与激素和防御胁迫应答相关的顺式作用元件。进化树分析结果表明,Gm GLP10与多个生长素结合蛋白进化距离较近,推断其可能具有相似的功能。Gm GLP10基因在菌核病菌胁迫下的转录本丰度的变化结果表明在菌核胁迫处理后Gm GLP10基因表达量上调明显。Gm GLP10可能作为生长素结合蛋白参与调控大豆的生长发育与抗病防御应答反应。

核盘菌对大豆致病力差异与抗氧化酶系统酶活性的关系

采集黑龙江省大豆菌核病样分离得到15个菌株,选用大豆离体叶片接种法鉴定菌株致病力强弱,测定致病力差异菌株体内POD、SOD、CAT活性。结果发现,黑龙江地区大豆菌核病菌致病力分化明显,菌株致病力分化与来源地无明显相关性;致病力差异菌株体内POD、SOD、CAT活性存在差异;60%供试菌株体内SOD、POD和CAT活性与致病力呈正相关,菌株致病力强则菌株体内相应的酶活性强;菌株CAT活性与其致病力相关性不明显,需进一步试验验证。