侵染浙贝母的百合斑驳病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

目的:制备抗百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)CP血清,为研究侵染不同植物LMoV之间的血清学关系以及大田检测LMoV奠定基础。方法:根据Genbank报道的百合斑驳病毒CP基因序列设计引物,扩增其外壳蛋白基因并分析序列。将LMoV CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然LMoV病毒结合。结果:LMoV的CP与目前已报道的LMoV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为95%～99%,氨基酸序列同源性为98%～100%。制备的抗体对CP具有高度特异性,且能够与天然LMoV病毒离子结合。结论:本研究制备的抗血清可以作为百合斑驳病毒的检测。

侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(FVY)CP基因的原核表达及抗血清制备(英文)

目的:制备抗侵染浙贝母的浙贝母病毒Y(Fritillary virus Y,FVY)CP血清,为大田检测FVY和研究FVY与其他病毒之间的血清学关系奠定基础。方法:根据Genbank报道的FVY CP基因序列设计引物,扩增其CP基因。Blast分析FVY CP基因核苷酸序列与其他马铃薯Y病毒属成员CP基因的同源性。将CP基因插入表达载体pSBET,转化大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株,通过IPTG诱导表达。经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次纯化CP,免疫小鼠获得抗CP血清,采用Western blot分析抗体的特异性。用原核表达的17种马铃薯Y病毒属病毒CP蛋白作为抗原,检测抗FVY CP血清是否能与其进行交叉反应。采用ELISA分析抗体能否与天然FVY病毒离子结合。结果:FVY CP基因与油点草病毒Y(TrVY)CP基因、大豆花叶病毒半夏分离物CP基因和小西葫芦黄花叶病毒六安分离物CP基因分别有81.2%、68.1%和67.2%的同源性。制备的抗体对FVY CP具有高度特异性,同时能与大豆花叶病毒半夏分离物(SMV-P)CP蛋白有中等强度的结合,与小西葫芦黄花叶病毒CP蛋白有弱的结合。结论:抗体能够与天然FVY病毒离子结合,因此可以作为该病毒的大田检测。

侵染辣椒的黄瓜花叶病毒CP基因的序列分析、原核表达及抗血清制备

从吉林长春感病辣椒上获得一黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)分离物(CMV-CC),根据GenBank中已登录的CMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因核苷酸序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法克隆到了长度为657 bp的目的片段。序列分析表明,CMV-CC与CMVI组各分离物核苷酸同源性为93.2%-97.9%。根据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树显示:38个CMV分离物可分为3个组,CMV-CC属于CMV的IB亚组。将CMV-CC CP基因与原核表达载体pET-22b(+)连接,在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达出分子量约27 kD的融合蛋白。表达的融合蛋白经树脂纯化后免疫家兔制备了抗血清。用间接ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting分析表明制备的抗血清对CP有高度特异性,为准确、快速地检测CMV奠定了基础。

大蒜A病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

根据GenBank报道的大蒜A病毒(GarV-A)序列设计引物、扩增其外壳蛋白基因并进行序列分析。结果表明,GarV-A的CP基因与目前已报道的两种GarV-A不同分离物CP基因的核苷酸序列同源性为98%-99%;氨基酸序列同源性均为98%。将GarV-A CP基因插入表达载体pSBET,在大肠杆菌BL21(DE3)Plys E菌株中诱导表达。CP经12%SDS-PAGE和5%-20%SDS-PAGE两次纯化,免疫小鼠获得抗CP血清,Western blotting分析表明确定制备的抗体对CP具有高度特异性,ELISA检测表明制备的抗体能够与天然病毒离子结合,因此可以作为该病毒的检测。

大蒜B病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

制备抗大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)CP血清,为研究侵染大蒜6种葱X病毒属(Allexivirus)病毒之间的血清学关系以及大田检测GarV-B奠定基础。该研究根据GenBank报道的GarV-B序列设计引物,扩增从六安市寿县分离获得的GarV-B外壳蛋白基因(CP)并进行序列比对分析。将GarV-B的CP基因插入表达载体pS-BET,在大肠杆菌BL21(DE3)plys E菌株中诱导表达。表达的CP经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化,免疫小鼠获得抗CP血清。Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然GarV-B病毒结合。结果显示:GarV-B的CP基因与目前已报道的GarV-B不同分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89%～90%,氨基酸序列同源性为92%～93%。表明制备的抗体对GarV-B的CP具有高度特异性,且能够与天然GarV-B病毒粒子结合。因此本研究制备的抗GarV-B的CP血清可以用于该病毒的检测。

大豆花叶病毒CP基因原核表达与抗血清制备

根据已报道的大豆花叶病毒(SMV)序列设计引物,扩增SMV的外壳蛋白(CP)基因,序列同源性分析结果表明,与目前已报道的SMV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为85.0%～96.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为87.9%～98.9%。将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中诱导表达。通过12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性。硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1∶3800的一抗,可用于田间SMV病样检测。

黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV上获得pEHISTEV-CGMMV-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,表达出分子量为19.5 kD的CGMMV CP融合蛋白。切胶回收诱导表达的CGMMV CP免疫家兔,制备抗血清。Western Blotting检测发现,制备的抗血清能与CGMMV CP发生特异性免疫反应,与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)无反应。琼脂双扩散试验测定,制备抗血清的效价为1∶16,ELISA测定效价为1∶1024。该血清特异性强、效价高,可用于CGMMV的检测。

洋葱黄矮病毒检测试剂盒的研制

根据已报道的洋葱黄矮病毒（OYDV）序列设计引物，扩增洋葱黄矮病毒（OYDV）六安分离物外壳蛋白（CP）基因。序列同源性分析结果袁明，与目前已报道的OYDV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为84．0％-95．8％，相应推测的氨基酸序列同源性为86．8％～97．6％。将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21（DE3）PlysS中诱导表达。通过12％SDS—PAGE和5％-20％梯度SDS—PAGE两次制备电泳纯化诱导产物，免疫家兔获得抗CP血清，Westernblot分析对CP具有高度特异性。硫酸铵沉淀初步IgG，然后用Protein A-RedSepharose亲和层析进一步纯化IgG，IgG与甘油1：1混合获得效价1：4800的一抗。将一抗、羊抗兔二抗和4-硝基苯基磷酸二钠组成OYDV检测试剂盒，可用于田间OYDV病样检测。

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT-PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5'端和3'端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL-C2X中构建重组表达载体MBP-P2N,MBP-P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP-P2N和MBP-P2C融合蛋白。MBP-P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用

以受番木瓜环斑病毒(Papaya ring spot virus,PRSV)侵染的番木瓜(Carica papaya)叶片为供试材料,采用RT-PCR方法克隆其外壳蛋白基因cp,并将其连接到原核表达载体pET-28b(+)上,酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性,将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索转化的表达宿主菌种类、IPTG浓度及诱导时间,获得高效表达PRSVcp的条件。SDS-PAGE分析结果表明,CP融合蛋白分子量为36.8kD。以Ni2+-NTA亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备得到高效价抗体,间接ELISA测定效价为1︰16384。Western blot检测结果表明,制备的抗血清可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过ID-ELISA检测田间样品证实了制备的抗血清与PRSV侵染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为PRSV的快速检测以及PRSV编码蛋白的功能研究奠定了基础。

芜菁花叶病毒长春分离物p3基因的克隆、序列分析及P3蛋白抗血清的制备

用RT-PCR方法从长春感染芜菁花叶病毒（ Turnip mosaic virus,TuMV）的十字花科蔬菜中扩增获得该病毒的p3基因,并对其序列进行了比较分析。结果表明,本研究所获得的10个TuMV分离物p3基因含1 065个核苷酸,其序列一致率为98.8%～99.6%,与GenBank中其他15个TuMV分离物核苷酸一致率为80.9%～99.4%。根据p3基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：25个TuMV分离物可分为4个组,本研究得到的10个TuMV分离物均属于basal-BR组。将TuMV JCR06分离物p3基因N端663 bp片段克隆至原核表达载体pET-28a（＋）,并在大肠杆菌BL21（DE3） pLysS中表达出分子量约为28 kDa的融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了P3蛋白的特异性抗血清。以TuMV侵染的萝卜为抗原,间接ELISA测定抗血清的效价为1∶2 048。Western blotting分析表明,制备的抗血清能与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。