猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间。SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近。Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性。

丹毒丝菌spaA基因免疫保护区的克隆与功能研究

本研究以丹毒丝菌XJ1249基因组DNA为模板,根据GenBank已发表的丹毒丝菌表面保护性抗原A (SpaA)的序列设计引物进行PCR扩增,得到大小约1 029 bp的spaA基因N端免疫保护片段(spaA-N)。将spaA-N连接到载体pGEX-4T-1上构建重组原核表达质粒pGEX-spaA-N,对重组质粒进行序列验证后,在IPTG的诱导下,表达和纯化重组蛋白r-SpaA-N,并研究其对小鼠的免疫保护作用。结果显示:分离纯化的重组蛋白具有免疫原性,并对小鼠具有免疫保护性,能够有效防止丹毒丝菌对小鼠的侵染。研究结果为进一步研究丹毒丝菌致病机理,开发新的猪丹毒诊断试剂盒和亚单位疫苗奠定了基础。

猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。

一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及spaA基因序列分析

从猪丹毒疑似病例肺脏中分离到1株革兰阳性小杆菌,编号为YN19071,对其进行形态学、分子生物学鉴定,并研究其致病性、耐药性以及spaA基因遗传进化关系。16S rRNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,结果显示分离株YN19071与猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)模式菌株ATCC 19414~T同源性99.9%,对小鼠有较强的致病性。spaA基因进化分析显示,YN19071与10株猪丹毒杆菌中国分离株之间的同源性为98.8%~99.5%,与疫苗株G4T10同源性为99.3%。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的spaA基因存在3个突变位点T609G、A635G和A671G,对应的氨基酸序列也存在3个突变位点I203M、E212G和E224G。本研究在首次对云南猪丹毒杆菌spaA基因遗传进化分析,对云南猪丹毒杆菌的疫苗免疫防控具有指导意义。

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和HindⅢ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.

猪丹毒丝菌spaA基因的敲除及其致病作用的初步研究

为阐明SpaA在猪丹毒丝菌致病中的作用,以临床分离的猪丹毒丝菌野生强毒株为材料采用DNA重组技术构建spaA基因敲除载体,并利用该敲除载体通过同源重组敲除强毒株的spaA基因,比较强毒株和敲除株对小鼠毒力的差异.结果表明敲除株相比野生株对小鼠的毒力降低102倍,这说明SpaA与猪丹毒丝菌的致病性有关.

猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析

为确定导致福建某猪场猪只发病的病原,从病猪心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验及PCR鉴定,确定为猪丹毒杆菌。SpaA基因测序结果表明该分离菌在第609位点处出现了由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,对应的氨基酸是由甲硫氨酸突变为异亮氨酸。致病性试验结果表明,2.1×108 CFU/mL的菌液10倍稀释后,感染28日龄健康昆明小鼠,该分离菌对28日龄健康小鼠的半数致死量为2.1×103.5 CFU/mL,死亡小鼠的剖解病变表现为心肌有白色坏死点,肝脏实变、坏死,肺出血和脾脏梗死等,并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对青霉素、红霉素、氨苄青霉素、强力霉素、先锋霉素、阿奇霉素等较为敏感。

猪丹毒丝菌的分离鉴定及其SpaA基因高变区域的序列分析

为确定来自广东韶关某猪场猪只发病的病原,从送检材料中分离纯化细菌,共分离到3株细菌,根据3株菌的形态特征、生化试验、16SrRNA基因序列结果确定3株细菌均为猪丹毒丝菌。药敏试验结果表明,3个菌株对22种常用抗生素表现出耐药。SpaA基因432bp高变区域的序列测定结果表明,3个菌株的序列一致,但区分于GC42株;将该序列在GenBank中进行Blast比对,获得39个高度同源的猪丹毒丝菌的SpaA基因序列;将所有43个序列采用MEGA5.05软件进行序列比对,发现5个氨基酸位点替换,根据这种多态性,可将所有菌株分为5个SpaA型,国内流行SpaAⅡ、Ⅲ、Ⅳ型,其中SpaAⅡ最流行,占分析的国内菌株的75%。

红斑丹毒丝菌SpaA抗原基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

参照红斑丹毒丝菌表面抗原A(SpaA)基因的核苷酸序列合成1对引物,对我国生产用红斑丹毒丝菌CVCC43005的SpaA全基因进行了PCR扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,SpaA基因全长1 881bp,含有1个开放性阅读框,编码626个氨基酸。与已提交的红斑丹毒丝菌血清型1a、1b、2a、2b、5、8、9、12、15、16、17、N型的氨基酸同源性为97.5%～100%,血清型4、6、11、19、21的氨基酸同源性为52.8%～55.2%。与已提交的丹毒丝菌血清型18的氨基酸同源性为57.5%～58.0%。采用Chou-Fasman和Karplus-Schulz方案预测蛋白质的二级结构和柔性区域;运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,按Jame-son-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N端的59～64、85～91、174～186、193～201、212～215、221～231、266～275、278～288、291～308、314～327、329～349、356～376、403～456、508～516、528～537、568～576和607～626。

一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究

为确定湖南省某猪场猪只发病死亡的病原,从送检猪组织中分离纯化获得1株革兰阳性菌,通过生化鉴定及16S rDNA测序对分离菌进行了鉴定,药敏试验验证分离菌的耐药性,并进一步测序分析了其毒力因子基因的遗传变异;最后通过动物试验研究了分离菌对小鼠的致病性。结果显示,分离菌呈针尖大小、半透明,生化鉴定为猪丹毒杆菌。药敏试验结果显示该分离株对青霉素、苯唑西林、氨苄西林等15种抗生素敏感。分离株16S rDNA序列与猪丹毒疫苗株G4T10的同源性为100%;与G4T10株相比,spaA基因高突变区存在4个突变位点,分别是A509C、C510A、A924C和C925T,相对应的氨基酸有3个突变位点,包括P170H、D308E和F309L,而其他毒力因子基因包括神经氨酸酶基因、荚膜多糖A、B和C基因序列则无变化。小鼠攻毒试验显示,当剂量为1.466×10^(3)CFU或更高时,小鼠呈全身败血症病理变化,死亡率100%,说明该菌株毒力较强;从死亡小鼠各脏器组织中可分离到与分离株形态特征一致的菌株。本研究成功分离鉴定了1株毒力较强的猪丹毒杆菌,为湖南省猪丹毒的流行病学及致病性提供了参考。

猪丹毒丝菌SpaA蛋白的表达与纯化

[目的]在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌spaA基因并纯化重组蛋白。[方法]利用PCR扩增猪丹毒丝菌临床分离株spaA基因,构建重组质粒p GEX-4T-1-spaA,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达融合蛋白GST-SpaA,并优化表达条件。最后采用GST琼脂糖纯化树脂纯化,SDS-PAGE和Western Blotting检测。[结果]成功扩增spaA基因,获得重组表达菌株BL21(DE3)/p GEX-4T-1-spaA;在菌体OD600为0.9时,加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L,34℃诱导6 h的条件下表达效果最好。经SDS-PAGE检测和纯化后得到大小为97 kDa的GST-SpaA;Western Blotting检测结果表明,GST-SpaA具有良好的免疫原性。[结论]成功在大肠杆菌中表达了SpaA蛋白,经纯化得到具有免疫原性的重组蛋白,为后续研制猪丹毒丝菌SpaA蛋白亚单位疫苗奠定基础。