Culture of Motor Neurons from Newborn Rat Spinal Cord

A protocol for the isolation, purification and culture of motor neurons from newborn rat spinal cord was described and the effect of glial cell line-derived neurotrophic factor （GDNF） on the growth of neurite of motor neurons was investigated in vitro. Spinal motor neurons （SMNs） were dissociated from ventral spinal cord of postnatal day 1 rats. The culture system for SMNs was established by density gradient centrifugation, differential adhesion, and use of serum-free defined media and addition of exogenous GDNF. After 72-h culture, the cells displayed the characteristic morphology of motor neurons, exhibited extensive neuritic processes and were positive for choline acetyl- transferase （CHAT） expression. The neurite length of SMNs in GDNF groups was significantly longer than that in control group （P〈0.05）. This protocol can be adapted for various postnatal motor neurons studies.

Electroacupuncture promotes the recovery of motor neuron function in the anterior horn of the injured spinal cord

Acupuncture has been shown to lessen the inflammatory reaction after acute spinal cord injury and reduce secondary injury.However,the mechanism of action remains unclear.In this study,a rat model of spinal cord injury was established by compressing the T8-9 segments using a modified Nystrom method.Twenty-four hours after injury,Zusanli（ST36）,Xuanzhong（GB39）,Futu（ST32）and Sanyinjiao（SP6）were stimulated with electroacupuncture.Rats with spinal cord injury alone were used as controls.At 2,4 and 6 weeks after injury,acetylcholinesterase（ACh E）activity at the site of injury,the number of medium and large neurons in the spinal cord anterior horn,glial cell line-derived neurotrophic factor（GDNF）m RNA expression,and Basso,Beattie and Bresnahan locomotor rating scale scores were greater in the electroacupuncture group compared with the control group.These results demonstrate that electroacupuncture increases ACh E activity,up-regulates GDNF m RNA expression,and promotes the recovery of motor neuron function in the anterior horn after spinal cord injury.

Protective effect of sodium valproate on motor neurons in the spinal cord following sciatic nerve injury in rats

BACKGROUND: Sodium valproate (VPA) is used to be an effective anti-epileptic drug. VPA possesses the characteristics of penetrating rapidly through the blood-brain barrier (BBB) and increasing levels of Bcl-2 and growth cone-associated protein (GAP) 43 in spinal cord. OBJECTIVE: To observe the effect of VPA on Bcl-2 expression and motor neuronal apoptosis in spinal cord of rats following sciatic nerve transection. DESIGN: Randomized controlled experiment. SETTING: Department of Hand Surgery and Microsurgery, Wuhan Puai Hospital. MATERIALS: A total of 30 male healthy SD rats of clean grade and with the body mass of 180-220 g were provided by Experimental Animal Center of Medical College of Wuhan University. Sodium Valproate Tablets were purchases from Hengrui Pharmaceutical Factory, Jiangsu. METHODS: The experiment was performed in the Central Laboratory of Wuhan Puai Hospital and Medical College of Wuhan University from February to May 2006. Totally 30 rats were randomly divided into two groups: treatment group (n =15) and model group (n =15). Longitudinal incision along backside of right hind limbs of rats was made to expose sciatic nerves, which were sharply transected 1 cm distal to the inferior margin of piriform muscle after nerve liberation under operation microscope to establish sciatic nerve injury rat models. Sodium Valproate Tablets were pulverized and diluted into 50 g/L suspension with saline. On the day of operation, the rats in the treatment group received 6 mL/kg VPA suspension by gastric perfusion, once a day, whereas model group received 10 mL/kg saline by gastric perfusion, once a day. L4-6 spinal cords were obtained at days 1, 4, 7, 14 and 28 after operation, respectively. Terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) technique and immunohistochemical method (SP method) were used to detect absorbance (A) of neurons with positive Bcl-2 expression. Apoptotic rate of cells (number of apoptotic cells/total number of cells×100%) was calculated. MAIN OUTCOME MEASURES: A value of neurons with positive Bcl-2 expression and apoptotic rate in spinal cord of rats in the two groups. RESULTS: A total of 30 SD rats were involved in the result analysis. ①expression of positive Bcl-2 neurons: A value of positive Bcl-2 neurons were 0.71±0.02, 0.86±0.04, 1.02±0.06 at days 4, 7 and 14, respectively after operation in the treatment group, which were obviously higher than those in the model group (0.62±0.03, 0.71±0.05, 0.89±0.04, t = 3.10-4.50, P < 0.05). ②apoptotic result of motor neurons: Apoptotic rate of motor neurons in spinal cord was (6.91±0.89)% and (15.12±2.34)% at days 7 and 14 in the treatment group, which was significantly lower than those in the model group [(9.45±1.61)%, (19.35±0.92)%, t = 2.39, 3.03. P < 0.05]. CONCLUSION: VPA can increase expression of Bcl-2 in spinal cord and reduce neuronal apoptosis in rats following sciatic nerve injury, and has protective effect on motor neuron in spinal cord of rats.

Transplantation of neurotrophin-3-transfected bone marrow mesenchymal stem cells for the repair of spinal cord injury

Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has been shown to be therapeutic in the repair of spinal cord injury. However, the low survival rate of transplanted bone marrow mesen- chymal stem cells in vivo remains a problem. Neurotrophin-3 promotes motor neuron survival and it is hypothesized that its transfection can enhance the therapeutic effect. We show that in vitro transfection of neurotrophin-3 gene increases the number of bone marrow mesenchymal stem cells in the region of spinal cord injury. These results indicate that neurotrophin-3 can promote the survival of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into the region of spinal cord injury and potentially enhance the therapeutic effect in the repair of spinal cord injury.

低强度脉冲超声在骨骼肌肉及运动神经系统中的生物学效应研究进展

低强度脉冲超声(LIPUS)是一种成本低、非侵袭性且安全性高的治疗方式,主要应用于骨骼肌肉系统疾病的治疗,尤其是骨折与骨不连的治疗。本文综述了LIPUS在多种骨骼肌肉及运动神经系统疾病中的治疗作用,并分析其可能的内在机制和潜在靶点,发现除了骨折与骨不连之外,LIPUS在治疗骨质疏松、肌肉损伤及运动神经系统疾病中同样具有临床应用前景。

2-AG对离体脊髓运动神经元外周传入突触传递的影响

目的:探究2-花生四烯酸甘油(2-AG)如何影响新生大鼠离体脊髓运动神经元(MN)外周传入所诱发出的兴奋性突触后电位(iDR-EPSP)。方法:本研究使用8~14 d新生SD大鼠,制备400~500μm厚的脊髓横切片,通过脊髓MN细胞内记录技术,观察2-AG对电刺激同侧背根诱发iDR-EPSP的影响。结果:在11个MN灌流5μmol/L 2-AG 15 min,观察到伴随膜电阻增大的去极化反应(P<0.01)。在15个MN灌流5μmol/L 2-AG 15 min,观察到iDR-EPSP幅度和曲线下面积均减小(n=15,P<0.01)。在9个MN累积灌流1、5和25μmol/L 2-AG各15 min均可诱导去极化反应,浓度依赖性减小iDR-EPSP的幅度(P<0.01)和曲线下面积(P<0.05)。对17个灌流25μmol/L 2-AG 15 min的MN使用表观受体动力学方法进行分析,结果显示,25μmol/L的2-AG可降低iDR-EPSP的表观最大反应(V_(max))和表观解离速率常数(K_(2))(P<0.05),但表观结合速率常数(K_(1))与表观平衡解离常数(K T)改变无统计学意义(P>0.05)。结论:2-AG对离体脊髓MN外周传入兴奋性突触传递呈现浓度依赖性抑制效应。

温针灸联合肌电生物反馈对脑卒中痉挛性偏瘫患者脊髓运动神经元兴奋性及运动功能的影响

目的探讨温针灸联合肌电生物反馈在脑卒中痉挛性偏瘫患者中的应用效果。方法将2020年3月至2021年3月在我院接受治疗的82例脑卒中痉挛性偏瘫患者根据治疗方案不同分为对照组(41例,肌电生物反馈)和研究组(41例,温针灸联合肌电生物反馈)。比较两组的治疗效果。结果治疗8周后,研究组的H波最大波幅、M波最大波幅、H波最大波幅/M波最大波幅低于对照组(P<0.05)。治疗8周后,研究组的Fugl-Meyer运功功能评价量表(FMA)、Berg平衡量表(BBS)评分高于对照组,腕关节、踝关节主动活动度大于对照组(P<0.05)。随访后,研究组的神经功能缺损程度评分(CSS)评分低于对照组,脑卒中专用生活质量量表(SS-QOL)评分高于对照组(P<0.05)。研究组的治疗总有效率高于对照组(P<0.05)。随访后,研究组的临床痉挛指数(CSI)、改良Ashworth痉挛评定量表(MAS)评分低于对照组(P<0.05)。结论温针灸联合肌电生物反馈能有效改善脑卒中痉挛性偏瘫患者的脊髓运动神经元兴奋性,提高运动功能。

Inhibition of Autophagy by Estradiol Promotes Locomotor Recovery after Spinal Cord Injury in Rats

17β-estradiol（E2） has been shown to have neuroprotective effects in different central nervous system diseases. The mechanisms underlying estrogen neuroprotection in spinal cord injury（SCI） remain unclear. Previous studies have shown that autophagy plays a crucial role in the course of nerve injury. In this study, we showed that E2 treatment improved the restoration of locomotor function and decreased the loss of motor neurons in SCI rats. Realtime PCR and western blot analysis revealed that the protective function of E2 was related to the suppression of LC3 II and beclin-1 expression. Immunohistochemical study further confirmed that the immunoreactivity of LC3 in the motor neurons was down-regulated when treated with E2. In vitro studies demonstrated similar results that E2 pretreatment decreased the autophagic activity induced by rapamycin（autophagy sensitizer） and increased viability in a PC12 cell model. These results indicated that the neuroprotective effects of E2 in SCI are partly related to the suppression of excessive autophagy.

衰老的脊髓小胶质细胞呈现表型异质并倾向性靶向运动神经元及其突触

研究发现小胶质细胞随着年龄的增长和疾病的不同而获得独特的区域依赖性有害特征,从而导致神经元功能障碍和大脑退化。然而,目前尚不清楚脊髓中的小胶质细胞是否表现出类似的表型异质性。本研究对3、16、23和30个月大的小鼠的脊髓小胶质细胞进行区域分析。我们使用光学和电子显微镜发现脊髓小胶质细胞在衰老过程中获得越来越活跃的表型,且该现象与区域无关。然而,衰老会导致腹侧而非背角的小胶质细胞失去其空间组织。衰老的腹角小胶质细胞也会聚集在运动神经元胞体周围,它们与运动神经元突触的接触增加;而运动神经元突触已被证明会随着年龄的增长而消失。这些发现表明,在衰老过程中小胶质细胞可能会影响运动神经元接收和传递运动命令的能力。为了更深入地研究衰老脊髓小胶质细胞,我们对FACS分离的3、18、22和29个月大小鼠的小胶质细胞进行RNA测序。我们发现,脊髓小胶质细胞在衰老过程中获得与大脑中小胶质细胞相似的转录特性,其中包括在小胶质细胞-神经元相互作用和炎症中发挥作用的基因表达的改变。到29个月大时,脊髓小胶质细胞表现出额外且独特的转录变化,已知并预计会导致衰老并改变溶酶体和核糖体调节。总之,这项工作为靶向小胶质细胞以改善脊髓中与衰老相关的变化,特别是运动回路的变化奠定了基础。

针刺对实验性脊髓损伤前角运动神经元酶学的影响

目的:探讨针刺对大鼠脊髓损伤前角运动神经元酶学的影响。方法:采用酶组织化学染色方法定性分析针刺治疗前后脊髓前角运动神经元乙酰胆碱酯酶(ACHE)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、酸性磷酸酶(ACP)的含量变化;同时,运用全自动图像分析仪系统进行定量分析。结果:脊髓损伤后ACHE和SDH含量减少(P<001);ACP含量增加(P<001)。而针刺组针刺后均较对照组同时段点ACHE、SDH酶含量高;ACP酶含量低(P<005,P<001)。结论:针刺能调节脊髓损伤后前角运动神经元酶含量,具有抑制或延缓神经元变性程度并能促进其恢复。

GDNF及HSV-GDNF对坐骨神经损伤大鼠脊髓运动神经元Bcl-2表达的影响

目的 观察胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)及单纯疱疹病毒 (HSV)载体介导的 GDNF(HSV-GDNF)对坐骨神经损伤大鼠脊髓运动神经元 Bcl- 2表达的影响。 方法 分别取坐骨神经损伤后 4d、7d和 14d大鼠(分成对照组、GDNF组和 HSV- GDNF组 )的腰段脊髓 (L4～ 6 ) ,行石蜡包埋、切片 ;用抗 Bcl- 2抗血清进行免疫组织化学染色 ,观察 Bcl- 2免疫反应 (Bcl- 2 - IR)神经元数目 ,并在图像分析仪上对 Bcl- 2 - IR阳性神经元作光密度的色谱分析。 结果 1.坐骨神经损伤后 4d、7d时 ,GDNF组和 HSV- GDNF组损伤侧脊髓运动神经元 Bcl- 2 - IR阳性神经元的数量和平均光密度均明显高于对照组损伤侧。2 .坐骨神经损伤后 14d时 ,对照组、GDNF组和 HSV- GDNF组损伤侧脊髓运动神经元对 Bcl- 2的表达已无明显差别。 结论 GDNF与 HSV- GDNF能够增强坐骨神经损伤大鼠脊髓运动神经元 Bcl- 2的表达 ,减少神经元的退化死亡。

GDNF对脊髓前角运动神经元的保护作用

目的 :证实胶质源性神经营养因子 (glialcellline derivedneurotrophicfactor ,GDNF)对脊髓前角运动神经元有保护作用。方法 :切断SD大鼠一侧坐骨神经建立脊髓前角运动神经元损伤模型 ,借助单盲端硅胶管系统在损伤神经局部给予GDNF ,术后不同时间分别取L5脊髓切片 ,利用酶组织化学染色方法显示胆碱酯酶 (CHE)和酸性磷酸酶 (ACP)活性并进行图像分析。结果 :坐骨神经切断可导致腰段脊髓前角运动神经元明显损害 ,表现为CHE活性降低 ,ACP活性升高 ;应用GDNF可显著改善上述酶学变化。结论

大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质神经元凋亡的观察

目的:观察大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质神经元的凋亡情况,探讨其相关因素。方法:SD大鼠72只,随机分为3组:阴性对照组(正常大鼠)、假手术组(单纯椎板切除)、脊髓损伤组(椎板切除+脊髓横断损伤),每组24只,各组分别于造模后1d、3d、7d、14d处死6只动物取材。应用原位末端标记法(TUNEL法)对脊髓损伤后大脑运动皮质区行神经元凋亡检查,并检测该区域神经元诱生型一氧化氮合酶(iNOS)的表达情况,分析神经元凋亡与iNOS表达的关系。结果:脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质区神经元在术后1d、3d、7d、14d的凋亡指数分别为(10.11±4.02)%、(56.53±8.63)%、(35.03±11.66)%、(3.78±1.03)%,均高于相应时间点阴性对照组和假手术组(P<0.05),术后3d凋亡指数显著高于术后1d、7d和14d(P<0.01)。术后1d、3d、7d、14d脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质iNOS阳性神经元百分数分别为(17.92±2.75)%、(60.65±8.78)%、(34.35±7.74)%、(6.12±1.99)%,1d、3d、7d时均高于相应时间点阴性对照组和假手术组(P<0.05),14d时三组间无显著性差异;脊髓损伤组术后3d时显著高于其余时间点(P<0.01)。脊髓损伤组大鼠大脑运动皮质区神经元凋亡指数与iNOS阳性神经元百分数之间存在显著性正相关关系(r=0.89,P<0.01)。结论:大鼠脊髓损伤后大脑运动皮质区神经元凋亡增加,其可能与iNOS的表达增加有关。

肌萎灵注射液对体外培养运动神经元的保护作用

目的:观察肌萎灵注射液(JWL)对体外培养运动神经元的保护作用。方法:应用密度离心法分离鼠胚脊髓运动神经元进行原代培养,加入谷氨酸建立兴奋性氨基酸毒性损伤模型,评价不同浓度肌萎灵注射液对运动神经元的保护作用。MTT法检测细胞活力,NF-200免疫组化染色并进行图象分析,测定神经突起主干长度,生化分析仪检测培养上清中的乳酸脱氢酶(LDH),TUNEL阳性神经元计数观察细胞凋亡。结果:(1)肌萎灵注射液能明显促进体外培养运动神经元的活力,促进神经突起的生长;(2)肌萎灵注射液可减少兴奋性氨基酸毒性损伤运动神经元LDH的漏出;(3)肌萎灵注射液能显著减少谷氨酸诱导的运动神经元凋亡。结论:肌萎灵注射液对正常运动神经元和兴奋性氨基酸毒性损伤运动神经元均具有保护作用。

针刺对大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元功能的影响

目的探讨针刺对脊髓损伤(SCI)大鼠前角运动神经元功能恢复的影响。方法成年雄性SD大鼠60只,改良Allen法压迫致伤T8、T9,随机分为实验组和对照组,伤后分别给予电针刺激大鼠双下肢足三里和悬钟、伏兔和三阴交穴,取治疗2,4,6周伤段脊髓进行PCR扩增和组织切片。利用RT-PCR技术检测伤区脊髓胶质源性神经营养因子(GDNF)mRNA基因体内表达的变化;应用尼氏染色、酶组织化学染色方法观察大鼠SCI后伤区脊髓前角运动神经元存活的数目和乙酰胆碱酯酶(AChE)的变化;采用斜板试验和BBB评分法观察大鼠后肢运动功能恢复情况。结果实验组较对照组AChE活性显著增加(P<0.01);实验组脊髓前角大、中型神经元的数目较对照组明显增加(P<0.05);实验组GDNF mRNA基因体内表达较对照组明显增加(P<0.01);大鼠SCI 3周后针刺治疗组后肢运动功能评分均明显高于对照组(P<0.05)。结论针刺治疗对脊髓损伤后前角运动神经元的功能恢复有一定的促进作用。

大鼠坐骨神经切断后GDNF mRNA在其向心端及脊髓表达的变化

目的 :探讨大鼠坐骨神经切断后胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) m RNA在其向心端及脊髓表达的变化及其意义。 方法 :在切断 SD大鼠双侧坐骨神经后的不同时间采用半定量 RT- PCR方法 ,观察坐骨神经向心端及 T1 2 ～ L1 段脊髓GDNF m RNA表达的变化。 结果 :坐骨神经切断前 ,GDNF m RNA在坐骨神经及 T1 2 ～ L1 段脊髓微量表达 ,切断后其向心端及 T1 2 ～ L1 段脊髓表达逐渐减少 ,伤后 1、7、14、2 8d分别减少 10 %、38%、4 5 %、5 2 %及 2 0 %、6 8%、80 %、85 %。 结论 :坐骨神经切断后其向心端及 T1 2 ～ L1 脊髓 GDNF m RNA表达减少 ,推测是由于失去靶组织转运 GDNF m RNA所造成 ,为外源性GDNF应用于治疗脊髓损伤提供了实验依据。

运动对小鼠寿命和脊髓前角神经元形态和数量的影响

用C_(57)BL/3J小鼠29只,分成运动组(12只),对照组(12只)和青年组(5只)三组.运动组从第6个月起隔天跑转笼2小时,对照组不跑转笼.当这两组小鼠死亡总数达50%时(经过16个月零8天),将两组余下的小鼠(22月龄)全部杀死,取出脊髓腰膨大(L_2)与青年组(6月龄)的相比较.结果表明:运动组与对照组的存活率无显著性差异,P>0.05;老年的小鼠脊髓前角神经元总数比青年组的少,但运动组神经元减少较轻,P<0.05,减少的主要的是小神经元,大、中神经元并没有减少;而对照组神经元减少明显,P<0.01,减少的主要是大、中神经元.在三组随机抽出的大神经元胞体切面面积中,运动组最大,青年组居中,对照组最小,两两比较P均<0.01.实验结果提示:长期适量的运动对小鼠的寿命影响不大,但可能会减轻脊髓前角神经元在衰老过程中的死亡程度,最明显的影响是将运动神经元保存下来.

胶质源性神经营养因子对脊髓损伤后前角运动神经元的保护作用

目的 :探讨胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)对脊髓损伤后运动神经元的保护作用。 方法 :大鼠分为假手术组、生理盐水 (NS)组和 GDNF组 ,改良 Allen法撞击致伤 T1 2 脊髓 ,蛛网膜下腔分别给予 NS和 GDNF,分别取不同时间的伤段脊髓进行切片 ,应用酶组织化学染色方法显示脊髓前角外侧核运动神经元中胆碱酯酶 (Ch E)和酸性磷酸酶 (ACP)活性 ,并结合计算机进行图像分析。结果 :GDNF组较 NS组 Ch E活性显著增加 ,ACP活性显著降低 ;2 1d时 NS组的 ACP及 Ch E活性均高于及低于假手术组 ;GDNF组与假手术组 Ch E和 ACP活性差别不显著。 结论

大鼠坐骨神经损伤后脊髓前角神经元死亡数量的研究

目的 :研究周围神经损伤后 ,脊髓前角运动神经元胞体的死亡数量变化。方法 :选择 10只正常SD大鼠 ,先计算两侧的脊髓前角运动神经元胞体数量是否对称 ;再选择 3 5只SD大鼠 ,切断并原位吻合其右侧坐骨神经 ,左侧不作任何处理、作为对照 ,于术后不同时间取L4～ 6节段脊髓作HE染色 ,计算脊髓前角运动神经元胞体数量的变化。结果 :正常SD大鼠两侧的脊髓前角运动神经元胞体数量呈对称分布 ;右侧坐骨神经损伤后 ,其脊髓前角运动神经元胞体数量较左侧减少。结论 :大鼠坐骨神经损伤后 ,脊髓前角运动神经元的胞体有死亡 ,其死亡具有一定的时间特征。

运动神经元病体外器官模型的建立

目的:利用微孔膜器官型脊髓组织片培养的方法,加入适当剂量的线粒体功能抑制剂丙二酸钠,造成选择性运动神经元数目减少从而建立肌萎缩侧索硬化症 (ALS)的体外器官模型。方法:取出生后 6天的SD乳鼠的腰段脊髓冠状切片后将脊髓片置于微孔膜上进行培养,首先经丙二酸钠量效检测确定最佳丙二酸钠剂量。在培养第 3天时加入适量的丙二酸钠,维持此浓度继续培养至第 15天时结束培养,并利用免疫组化方法行运动神经元及中间神经元计数。结果:经丙二酸钠量效检测后确定 2mmol/L为最佳加入剂量 (存活率为 75%,P<0. 01)。造模实验结果显示,对照组的脊髓片内的运动神经元数目为每半侧 ( 15 29±1. 70 )个,丙二酸钠组为每半侧 ( 11. 00±2. 45)个, 两组比较差异有统计学意义(P<0. 01);两组中间神经元的数目略有减少,但两组间差异无统计学意义。结论:利用微孔膜进行器官型脊髓片培养并加入 2mmol/L丙二酸钠造成的此病理模型符合运动神经元病患者的特点,可重复性强,适用于ALS的发病机制、治疗等方面的研究。