抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体的构建

采用毕赤酵母偏爱原则,人工设计合成抗菌肽Spinigerin基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有Spinigerin插入基因的重组质粒pPICZαA-S,结果表明成功构建了抗菌肽Spinigerin基因真核表达载体pPICZαA-S。

Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

在已获得Spinigerinα抗菌肽摇瓶发酵条件的基础上,对其在50 L发酵罐中的初始甘油质量浓度、补料方式、甲醇与山梨醇混合比例、诱导温度、诱导pH值和诱导时间进行优化,并对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值进行正交试验。结果表明:甘油初始质量浓度10 g/L、补料方式为变速补料、甲醇与山梨醇混合体积比1∶1、诱导时间96 h、诱导温度24℃、诱导pH 5.0。在此最佳发酵条件下,50 L发酵罐的Spinigerinα抗菌肽产量较摇瓶条件提高20%。

Spinigerin α抗菌肽摇瓶培养条件研究

在已构建重组毕赤酵母工程菌研究的基础上,对该工程菌的摇瓶培养条件进行优化,并对培养pH、培养温度、甘油补料速率三者的影响进行正交试验,最后获得最佳摇瓶培养条件:种子液最佳培养时间为18 h,接种量10%,摇床转速250 r/min,pH6.0,培养温度28℃,甘油补料量速率为4 g/(L·h)。在此最优摇瓶培养条件下,Spinigerinα抗菌肽产量达到16 mg/L。

Spinigerin α抗菌肽的理化特性研究

本研究在对Spinigerin α抗菌肽成功的进行了克隆及表达的基础上,对Spinigerin α抗菌肽的理化性质,包括抑菌特性、温度、pH稳定性等外界条件对其抗菌活性的影响进行了进一步研究。研究结果表明:Spinigerin α抗菌肽的自身浓度、温度、及pH对其抑菌活性均有重要影响,对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为1.52%、3.13%、12.5%。当抗菌肽加热至60-100℃时,抗菌肽抑菌效果依然明显,当加热至121℃时,其抑菌效果开始有下降趋势。当处于pH值6.0-8.0的近中性环境中,Spinigerin α抗菌肽的抗菌活性最强。

抗菌肽Spinigerin α′基因的表达及其抑菌效果的研究

选择毕赤酵母GS115作为表达宿主,对抗菌肽Spinigerinα的突变体Spinigerinα′的基因进行胞外分泌表达,并选用致病性大肠杆菌、致病性的肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌作为敏感菌株,采用琼脂空穴扩散法对表达液进行抑菌效果的研究,并将其抑菌效果与突变前的抗菌肽Spinigerinα进行对比。结果表明,抗菌肽Spinigerinα′-1的抑菌活性降低,Spinigerinα′-2抑菌活性稍有增加,Spinigerinα′-3的抑菌活性最强,而Spinigerinα′-4和5酵母表达的蛋白无抑菌活性。为抗菌肽抑菌效果提高的研究奠定重要的基础。

Spinigerin α抗菌肽的分离纯化及其活性研究

Spinigeriα抗菌肽是一种源于白蚁的线性抗菌肽，包括25个氨基酸，不含半胱氨酸，呈α-螺旋结构。本研究采用凝胶加热一层析法，对Spinigerinα抗菌肽样液通过水浴加热至100％保持20～30min，除去不耐热的部分蛋白，经葡聚糖凝胶SephadexG-25脱盐层析分离得到Spinigerinα抗菌肽提纯物。根据SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱绘制分子质量标准曲线，计算Spinigeinα抗菌肽的分子质量。试验结果表明：SDS-PAGE电泳表现为单一条带，其分子质量为2．74ku；Spinigerinα抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，最小抑菌浓度分别为0．5mg／mL、0．3mg／mL、0．2mg／mE。

抗菌肽Spinigerin α基因定点突变体的构建

通过对Spinigerin α抗菌肽的结构分析,结合抗菌肽的抗菌机理,根据毕赤酵母的偏爱密码子对该抗菌肽进行定点突变。将亲水性氮端的碱性赖氨酸分别突变为碱性更强的精氨酸、酸性的天冬氨酸以及中性的丙氨酸,将疏水性碳端的中性亮氨酸突变成碱性的精氨酸、酸性的天冬氨酸。将定点突变后的Spinigerin α基因按正确阅读框克隆至穿梭质粒pPICZ α-A上,经PCR鉴定、序列分析,所转化的宿主酵母GS115中含有该突变体,结果表明已成功构建了抗菌肽Spinigerin α基因的突变体,为获得高效的抗菌效果的抗菌肽奠定一定的基础。