斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)基因组EcoRI-G片段的序列分析

斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltNPV)基因组EcoRI G片段全长 745 0bp ,包括 7个开放读码框 :vp39、lef 4、cg30、p91、vp33、tlp2 0、AcMNPVORF81同源基因和一个同源区 (hr)。基因组排列比较分析发现 ,这些基因在基因组中的排列 。

1×10^9 PIB/g SpltNPV·15%虫酰肼悬浮剂对甘蓝斜纹夜蛾的田间防效

用1×109PIB/g斜纹夜蛾核型多角体病毒·15%,虫酰肼悬浮剂进行了甘蓝斜纹夜蛾的田间药效试验。结果表明:供试药剂对甘蓝斜纹夜蛾具有良好的防治效果,田间制剂用量1 500 g/hm2时,药后3天对甘蓝斜纹夜蛾幼虫的防效达到80%,以上,且持效期达14 d,显著优于对照药剂1×109PIB/g斜纹夜蛾核型多角体病毒可湿性粉剂1 500 g/hm2的防效和持效期,说明1×109PIB/g斜纹夜蛾核型多角体病毒·15%,虫酰肼悬浮剂在防治甘蓝斜纹夜蛾上具体良好的推广应用前景。

斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒的巢式PCR检测

旨在建立一种快速、可靠的斜纹夜蛾成虫带核型多角体病毒(Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)的分子检测方法,以克服目前常规PCR技术很难检测到斜纹夜蛾成虫带病毒的缺陷。以SpltNPV的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(ecdysteroid UDP-glucosyltransferase,egt)基因为检测对象,基于该基因序列设计了巢式PCR引物,其中一对外侧引物egt-F/R和一对内侧引物egt1-F/R,并研究斜纹夜蛾成虫带毒的巢式PCR检测可靠性。结果表明:基于egt基因的巢式PCR方法可以特异性扩增SpltNPV的DNA,引物egt-F/R的扩增检测最低限为10-7μg/μL;且基于引物egt-F/R的两轮普通PCR无法检测出成虫带毒,而采用巢式PCR方法可有效扩增出目的egt片段,巢式PCR检测方法的灵敏度比两轮普通PCR检测方法提高2个数量级。因此,本研究成功建立了基于SpltNPV的egt基因的巢式PCR检测技术,该方法为斜纹夜蛾成虫带毒、传毒等流行病学研究提供了可靠的技术支撑。

5亿PIB/mL SpltNPV·15%虫酰肼悬浮剂的研制

研制了一种新型复合型农药制剂—5亿PIB/mL斜纹夜蛾核型多角体病毒.15%虫酰肼悬浮剂。通过选择润湿分散剂、黏度调节剂、防腐剂、抗冻剂和消泡剂等助剂,确定了最优配方为:斜纹夜蛾核型多角体病毒5亿PIB/mL,虫酰肼15%,农乳34#2%,农乳500#3%,SP-2700 2%,黄原胶0.05%,硅酸铝镁1%,苯甲酸钠0.3%,乙二醇2%,异辛醇0.2%,余量水。产品悬浮率90%以上,冷热贮等各项指标合格,产品质量稳定。

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,克隆了多角体蛋白基因 ,并进行了序列分析和比较。结果表明 :(1)SpltMNPV日本分离株K 3、G1 2和G10 3分别具有不同的特征性酶切图谱 ,分别属于 3种基因型 (A型、B型和C型 ) ;(2 ) 3个分离株的芽生型病毒 (buddedvirus)产生能力和多角体产生能力有差异 ,免疫印迹分析表明 ,多角体蛋白的分子量也不同 ;(3)日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由 74 7个核苷酸编码序列 (编码 2 4 9个氨基酸 )组成 ,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为 98 9% ,与其他 6种核型多角体病毒有较高的同源性 (6 1 7%～ 74 2 % ) ,但其 5′端侧翼序列 (nt_1～_10 0 )与AcMNPV和BmNPV相比差异显著 ,在对该基因表达调控起决定性作用的 8个高度保守核苷酸序列中 (nt_4 4～_5 1)有 2处发生自然突变。

斜纹夜蛾核型多角体病毒与两种亚致死剂量的农药混用对斜纹夜蛾体内三种抗氧化酶活性的影响

在(28±1)℃下,以斜纹夜蛾Spodopteralitura为靶标昆虫,测定亚致死剂量的乐斯本、除尽与斜纹夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)混用后对幼虫SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)和POD(过氧化物酶)活性的影响。结果表明,乐斯本和SlNPV混合悬液处理后斜纹夜蛾体内SOD活性显著高于清水、病毒和乐斯本单独处理组,12 h、24 h和36 h时分别为清水对照的1.18、1.35和1.25倍;除尽和SlNPV混合悬液处理后12 h,其酶活性低于清水、SlNPV和除尽单独处理组。乐斯本和病毒混合悬液处理后,斜纹夜蛾体内CAT活性高于清水、病毒和乐斯本单独处理组,12 h、24 h和36 h时分别为清水对照组的2.79、1.09和1.53倍;除尽和病毒的混合悬液处理后,其酶活性除12 h时明显高于清水对照外,其他时间均低于清水对照。在正常和中毒的斜纹夜蛾体内均未测出POD活性。可见,农药与病毒混合处理主要影响了CAT活性。

保幼激素类似物对斜纹夜蛾核多角体病毒增殖的影响

分别用5×106,1×107,5×107,1×108PIBs/mL4种浓度的斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)感染斜纹夜蛾末龄幼虫(第6龄),并于同龄期以10μg/头的保幼激素类似物(JHA)methoprene分别对各感染组进行点滴处理,以研究JHA对SpltNPV增殖的影响。研究表明,与对照组相比各不同浓度处理组病毒总产量分别提高227.06%、128.71%、52.62%、33.15%,平均单头病毒含量分别提高49.15%、48.40%、36.40%和31.11%,病毒感染死亡率分别提高119.21%、52.72%、12.64%和1.12%。其中以1×107PIBs/mL感染再经JHA处理的病毒总产量和平均单头病毒含量最高,分别为1701.8×108PIBs和60.1×108PIBs。各处理组的病毒总产量和平均单头病毒含量均显著高于其对照组。在此基础上,进一步研究了JHA对染毒与未染毒宿主消化生理的影响。结果表明,JHA处理不仅延长了6龄幼虫的寿命,增加了其取食量,而且还显著提高了幼虫的食物转化率和病毒产量。

斜纹夜蛾核多角体病毒与增效剂混配对斜纹夜蛾幼虫的防治效果

研究斜纹夜蛾核多角体病毒与增效剂混配对斜纹夜蛾幼虫的防治效果。结果表明 ,增效剂可以提高病毒剂的杀虫效果 ,每 1 0 0 ml病毒剂 (1× 1 0 7PIB/ml)加入增效剂 0 .0 4g的防治效果最好。利用稀释 1 0 0 0倍的病毒可湿性粉剂防治银纹夜蛾、小菜粉蝶、小菜蛾幼虫 ,防效分别为 46 .7%、6 0 .0 %、47.2 %。

斜纹夜蛾核型多角体病毒对宿主子代的弱化作用

用9.44×108 OB/mL和9.44×107 OB/mL病毒液分别饲喂斜纹夜蛾(Spodoptera litura)幼虫和成虫,观察斜纹夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)对宿主子1、2代的影响。结果表明:斜纹夜蛾4～6龄初幼虫饲毒后,F1代、F2代化蛹率分别下降了12.73%～18.59%、5.88%～10.21%,羽化率分别下降了11.31%～15.41%、5.70%～8.46%;成虫饲毒后,F1代、F2代化蛹率分别下降了14.00%～34.63%、8.33%～9.84%,羽化率分别下降了10.77%～19.61%、11.36%～12.00%;4～5龄幼虫饲毒和成虫饲毒后,F1代、F2代的蛹质量明显降低,产卵量显著下降,产卵期和雌雄成虫寿命明显缩短,但F1代、F2代幼虫历期、蛹期和产卵前期与对照差异不显著。试验结果还表明,随着宿主子代数的增加,核型多角体病毒对子代的弱化作用越来越不明显。

斜纹夜蛾核型多角体病毒研究进展

斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)是一种世界性分布的杂食性害虫,经常暴发成灾,给农业生产带来巨大损失。斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltNPV)能有效控制斜纹夜蛾种群数量,是有效防治斜纹夜蛾的生物制剂,具有重要的经济、生态和环保价值。本文从毒力、流行病学、分子生物学、复配剂及其田间应用和对斜纹夜蛾天敌的影响等方面综述了斜纹夜蛾核型多角体病毒的研究进展。

斜纹夜蛾核多角体病毒gp37及其邻近序列的克隆及分析

从斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituranucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)基因组中克隆了 gp37基因 .分子生物学软件分析表明 ,在 gp37基因内部存在糖基化位点 .含有晚期表达基因的启动子序列(ATAAG) ,推测为晚期表达的病毒膜糖蛋白基因 .通过GP37蛋白的同源性比较 ,绘制了以 gp37基因为基础的杆状病毒进化树 ,发现与以多角体蛋白基因 (polyhedrin)为基础所绘制的杆状病毒分子进化树有较大差异 .以polyhedrin基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒 (Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)与杆状病毒代表种———苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (Autographacalifornicamultinucleocapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)分开 ,根据 gp37基因分析则将二者归到同一分枝 。

斜纹夜蛾核型多角体病毒基因ⅡORF13的克隆、表达与启动子活性分析

【目的】研究新发现的斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ株基因ORF13的结构与功能。【方法】根据SpltMNPV Ⅱ ORF13基因序列设计引物,经PCR扩增并克隆ORF13。在生物信息学分析基础上进行启动子活性分析和转录时相分析。构建ORF13片段的原核表达载体,表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体。【结果】核苷酸序列分析表明,起始密码子上游-84bp处发现杆状病毒晚期启动子基序ATAAG,没有发现明显的早期启动子基序。启动子活性分析和转录时相分析证实,ORF13是一个早期和晚期都表达的基因,在病毒感染2 h就开始转录,18 h达到最高峰,24 h以后转录水平有所下降,但基本维持恒定。pET-28a-ORF13原核表达的融合蛋白经纯化后制备的多克隆抗体特异性高,效价可达1:3200以上。【结论】SpltMNPV Ⅱ ORF13是一个早期和晚期都表达的病毒组成型结构蛋白基因。ORF13编码的蛋白可能是一种BV的膜蛋白,与细胞跨膜转运有关,制备的多克隆抗体可用于深入研究该蛋白的生物学特性与功能。

广西斜纹夜蛾核型多角体病毒的分离鉴定

从广西部分地区采集到自然罹病死亡的疑似具有病毒症状的斜纹夜蛾幼虫,对其进行病毒的分离鉴定。用研磨病虫尸体得到的浆液,经分离纯化后感染连续人工饲养至第三代的健康斜纹夜蛾三龄幼虫,部分样品能诱发病毒病症状。经差速离心的提纯物,在相差显微镜下观察到外形不规则的颗粒,进一步在电镜下观察到菱形、五边型、六边形、近似圆形等形状的多角体。用依据Splt NPV DNA的egt基因保守序列设计的引物,对多角体中提取的DNA进行PCR扩增,得到了与预期一致的3 80 bp片段。经测序分析,该PCR片段与Splt NPV egt基因在核苷酸水平上的同源性为99.4%,演绎的氨基酸水平上的同源性为1 0 0 %。进一步对采自广西1 6个地域的疑似具有病毒症状的2 0 0份斜纹夜蛾幼虫样本进行PCR扩增,其中6个地域的62份样本呈PCR阳性,这表明,广西斜纹夜蛾自然种群中存在着Splt

C型斜纹夜蛾核型多角体病毒X_(17)病毒株部分基因的序列分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nucleopolyhdrovirus,SpltMNPV)X17株是采用活体克隆法自SpltMNPV日本小笠原株分离的病毒克隆。为了揭示X17病毒株基因型,根据已发表的SpltMNPVⅡ基因组全序列(GenBank登录号:NC_011616)设计引物,PCR扩增多角体蛋白基因(polh),并与SpltMNPV不同基因型及37种其他核型多角体病毒(NPV)作分子进化比较。系统发育树显示:SpltMNPV分为SpliNPV(A)型、SpltMNPV(B)型和SeMNPV(C)型3种基因型,此结果与前人利用基因组酶切图谱的研究结果一致。X17与SpltMNPV-1和SpltMNPVⅡ处于一个分支,属于SeMNPV(C)基因型,与A型和B型相距较远。此外,扩增了X17病毒基因38.7kD,Lef-1,Lef-9,fp,p10和p74,并与SpltMNPV,SpltMNPVⅡ,SeMNPV和SfNPV的同种基因进行同源性比较。结果表明,基于这6个ORF,X17与SpltMNPV同源性最低,其中Lef-9的氨基酸序列一致性最高,也仅为69%,38.7kD的氨基酸序列一致性只为26%。多数基因X17与SpltMNPVⅡ和SeMNPV的同源性较高,其中fp25K的氨基酸序列一致性最高,分别达95%和96%;但也有些基因同源性较低,如38.7kD的氨基酸序列一致性均为64%。因此,X17应是SpltMNPVC基因型的一种新毒株,命名为SpltMNPVⅡ-1。该研究为X17病毒株的进一步研究利用奠定基础。

复配型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒制剂对两种夜蛾的毒力测定

对防治蔬菜甜菜夜蛾（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａＨüｂｎｅｒ）和斜纹夜蛾（ＰｒｏｄｅｎｉａｌｉｔｕｒａＦａｂｒｉｃｉｕｓ）为主并兼治菜螟、菜青虫、小菜蛾等鳞翅目害虫的单一型和复配型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＡｃＭＮＰＶ）生物杀虫剂进行筛选。毒力测定结果表明：选用单剂的ＡｃＭＮＰＶＡ株（从甜菜夜蛾虫体增殖获得）的毒力（ＬＤ５０＝１３１．８ＰＩＢ／头）比ＡｃＭＮＰＶＢ株（从草地贪夜蛾细胞株Ｓｆ９中获得）的毒力（ＬＤ５０＝１９４９．４ＰＩＢ／头）高１４．７９倍。ＡｃＭＮＰＶＡ株加苏云金杆菌（Ｂｔ）加斜纹夜蛾核型多角体病毒（ＰｌＮＰＶ）形成的复配型ＡｃＭＮＰＶＡ株制剂对甜菜夜蛾二龄幼虫的ＬＤ５０值（２１．８２～２１．４ＰＩＢ／头）与单剂ＡｃＭＮＰＶＡ株的ＬＤ５０值（１６８．８４～２０４．３６ＰＩＢ／头）比值为９．５～７．７倍。同样复配型ＡｃＭＮＰＶＡ株制剂对斜纹夜蛾二龄幼虫ＬＤ５０（３．１６～１５．４６ＰＩＢ／头）与单剂ＰｌＮＰＶＬＤ５０值（１６．０２～５３．５３ＰＩＢ／头）比值为５．１～３．５倍。说明以Ｂｔ和非耙标害?

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株ORF63基因的序列特征及表达与启动子活性分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltMNPVⅡ)分离株是繁殖率和毒力极强的新型病毒株,ORF63是该病毒分离株的一个功能未知基因。从SpltMNPVⅡ分离株基因组中克隆了ORF63。序列分析表明,该基因读码框为1 071 bp,编码356个氨基酸,蛋白质分子质量为41.3 kD;起始密码子ATG上游存在一个早期和晚期启动子基序,编码蛋白序列含有CNX、MutH等多种结构域。启动子活性和转录时相分析表明ORF63是一个早、晚期表达的基因,在病毒感染4 h和18 h时有2个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但总体趋于稳定。构建该基因的原核表达载体pET-28a-ORF63,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体,Western blot检测制备的多克隆抗体特异性较好,效价可达1∶3 200以上。由以上结果推测,SpltMNPVⅡ分离株的ORF63基因是一个早期和晚期均有表达的病毒基因,可能与SpltMNPVⅡ感染宿主细胞后自身DNA的复制有关,参与早期芽生病毒(BV)的发生和晚期包涵体衍生病毒(ODV)的成熟2个过程。

斜纹夜蛾核型多角体病毒分子生物学研究进展

斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera lituramulticapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)属NPV科A亚群。近几年有关该病毒的序列测定、基因结构、功能和表达调控等系统的分子生物学研究工作进展迅速,特别是对一些重要基因的结构分析,有助于筛选毒力较强的杀虫毒株,并为这一病毒杀虫剂的改良和发展以及组建昆虫杆状病毒表达载体奠定基础。综述了与SpltMNPV相关的分子生物学领域的研究进展。

斜纹夜蛾核型多角体病毒日本株(C3)ie0基因的序列分析和表达

从斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)日本株(C3)基因组中克隆了ie0基因。核苷酸序列分析表明,该克隆片断涵盖了864 bp的读码框及5′端启动子区475 bp和3′端终止区90 bp的序列。氨基酸序列分析显示,在SpltMNPV IE0蛋白N-端23～47位以及111～126位富含酸性氨基酸和疏水性氨基酸残基,C′端第225～271位具有典型的CX2CX14CCX4CX2CX15CX2C双锌指基序,该结构在所比较的9个昆虫杆状病毒IE0蛋白中是十分保守的。联配分析表明,SpltMNPV日本株(C3)的核苷酸序列和氨基酸序列与其他9种核多角体病毒的同源性有较大差异。以ie0基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树将家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nu-cleopolyhedrovirus,BmNPV)与苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multicapcid nucle-opolyhedrovirus,AcMNPV)归到同一分枝,这与以p10、gp37和egt基因为基础绘制的杆状病毒分子进化树结果一致。并进行了大肠杆菌表达和Western Blotting分析。

斜纹夜蛾核型多角体病毒少多角体遗传突变株的鉴定

【目的】研究病毒基因感染昆虫宿主的分子机制。【方法】从自然界分离和鉴定斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)的遗传突变株,筛选到少多角体基因突变株-SpltMNPVB型株,克隆该株的少多角体基因(fp25K)。对不同株系SpltMNPV的fp25K进行序列分析、病毒感染的细胞培养和虫体感染试验。【结果】核苷酸序列分析表明,与中国株相比,A型和C型分别发生了4个和3个核苷酸改变,但编码的氨基酸不变;B型株3′端核苷酸发生了多处缺失和一处插入,导致FP25K蛋白C端21个氨基酸改变。病毒感染的细胞培养试验表明,fp25K基因突变导致多角体明显减少的表型。虫体试验表明,感染fp25K突变的SpltMNPV B型株的宿主液化减弱。【结论】SpltMNPV B型株是一株自然的少多角体遗传突变株,该突变株可用于更深入地解析少多角体表型成因、病毒感染后虫尸降解和液化作用的分子机制。