人源R-spondin 2蛋白的生物信息学分析、表达、纯化及活性检测

目的构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性。方法基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu。将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白。最后,通过M50Super 8×TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性。结果生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95%的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC50值为1.5×10^(-12)mol/L。结论对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考。

Spondin-2在肝细胞癌组织中的表达及对预后的预测价值

目的探讨脊椎蛋白-2(Spondin-2)在肝细胞癌(HCC)组织中的表达及对患者预后的预测价值。方法选择2019年5月至2020年1月连云港市第一人民医院收治的89例HCC患者作为研究对象,患者均接受HCC根治术,术后随访3年。术中采集入组患者的HCC组织和癌旁组织,采用免疫组织化学法检测组织中Spondin-2的表达水平,并分析HCC组织中Spondin-2的表达与患者临床病理特征的关系。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,以log-rank检验分析HCC组织中Spondin-2的表达与患者无瘤生存率的关系。采用Cox比例风险回归模型分析影响HCC患者复发的因素。结果HCC组织中Spondin-2的阳性表达率显著高于癌旁组织(82.02%比51.69%),差异有统计学意义(P<0.001)。低分化、肿瘤包膜不完整、TNM分期Ⅲ期、有微血管侵犯者的HCC组织中Spondin-2的阳性表达率分别高于中高分化、肿瘤包膜完整、TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无微血管侵犯者,组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。多因素Cox回归模型分析结果显示,肿瘤包膜完整性、分化程度、微血管侵犯、TNM分期和Spondin-2均是影响HCC患者术后复发的独立危险因素(P均<0.05)。随访结果显示,89例HCC患者中有7例失访,在其余82例患者中,Spondin-2阴性表达者(14例)中有12例无瘤生存,Spondin-2阳性表达者(68例)中有27例无瘤生存。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,Spondin-2阳性表达者的无瘤生存率(39.71%)显著低于Spondin-2阴性表达者(85.71%),2组的差异有统计学意义(log-rankχ^(2)=5.355,P=0.021)。结论HCC组织中Spondin-2的表达与患者临床病理特征及预后均密切相关,且Spondin-2阳性表达者的预后不良风险较高。

细胞外基质蛋白spondin2在人胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨细胞外基质蛋白spondin2(SPON2)在人胃癌组织中的表达及其与胃癌发生的关系。方法:收集2014年6月至2016年7月在苏州大学附属张家港医院行胃癌根治术75例患者的胃腺癌和相应癌旁组织,应用免疫荧光化学染色观察SPON2蛋白在胃癌及癌旁组织的细胞定位,应用免疫组化染色检测SPON2蛋白在胃腺癌及癌旁组织中的表达,分析SPON2蛋白表达与胃癌患者临床病理特征的关系。结果:SPON2蛋白定位于胃癌细胞的胞膜、胞质及胞外基质中,SPON2蛋白在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(72.0%vs 16.0%,P<0.01)。SPON2蛋白表达与肿瘤细胞分化程度以及患者的性别、年龄无关,与胃癌肿块大小、TNM分期、浸润程度、淋巴结转移有关(均P<0.05)。结论:SPON2蛋白在胃癌组织中的高表达与胃癌的发生发展有关,其有可能作为新的胃癌早期诊治靶点,并可能预测患者的预后及转归。

Spondin2在结肠炎发生过程中的表达

目的:研究Spondin2的表达调控及其所涉及的信号通路.方法:用含3%葡聚糖硫酸钠饮用水连续喂养C57BL/6小鼠6d,诱导急性结肠炎,然后将小鼠处死,取其结肠组织提取RNA分析.通过定量RT-PCR分析Spondin2 mRNA和核因子-κBp65的表达.应用不同细胞因子和Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)配体分别刺激细胞,RT-PCR分析Spondin2 mRNA的表达.结果:与对照组比较,在葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎模型上,Spondin2的mRNA表达上调4.5±0.5倍.TLR-9配体,CpG-ODN刺激野生型RAW264.7细胞后,Spondin2表达上调4.3±0.4倍.结论:在结肠炎发生过程中Spondin2的mRNA表达上调,并可能通过了TLR-9介导的信号通路.

血清标志物ProGRP、Spondin-2、PSA联合SPECT检查对前列腺癌骨转移的诊断价值

目的:探讨血清标志物胃泌素释放肽前体(ProGRP)、脊柱蛋白-2(Spondin-2)、前列腺特异性抗原(PSA)联合单光子发射型计算机断层成像(SPECT)检查对前列腺癌(PCa)骨转移的诊断价值。方法:收集2018年7月~2020年7月弋矶山医院确诊的62例PCa患者,骨转移组40例,无骨转移组22例;检测血清标志物ProGRP、Spondin-2、PSA。比较两组患者ProGRP、Spondin-2、PSA差异,分析其与PCa骨转移的相关性。结果:与无骨转移组比较,骨转移组患者Spondin-2、ProGRP、PSA升高(P<0.05);>2个骨转移灶患者与≤2个骨转移灶患者相比,血清Spondin-2增高(P<0.05),而两组骨转移患者PSA及ProGRP比值差异无统计学意义(P>0.05)。3组患者fPSA/PSA比值差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析显示,血清标志物PSA(OR=1.149)、Spondin-2(OR=1.438)、ProGRP(OR=1.211)水平升高是PCa骨转移的危险因素(P<0.05)。结论:血清标志物ProGRP、Spondin-2、PSA与PCa骨转移相关,为其危险因素;fPSA/PSA与骨转移无关。

胃癌患者组织中FOXK1、SPON2表达的临床意义及对预后的影响

目的探讨胃癌患者组织中叉头框转录因子(FOXK1)、脊椎蛋白2(SPON2)表达的临床意义及对预后的影响。方法前瞻性选取张家港市第一人民医院2017年1月至2019年12月收治的98例胃癌患者作为研究对象,所有患者行胃癌根治性切除术治疗并获取胃癌组织标本,术后均接受随访(12个月),依据随访期间预后情况分为预后良好组和预后不良组(复发、病死)。检测并比较2组FOXK1、SPON2表达,分析胃癌患者组织中FOXK1、SPON2表达对预后影响。结果98例胃癌患者中,预后不良患者17例,占17.35%;预后不良组FOXK1、SPON2阳性表达率高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05);组间其他资料比较差异无统计学意义(P>0.05);经Logistic回归分析检验,结果显示,FOXK1、SPON2表达阳性可能与胃癌患者预后不良有关(OR>1,P<0.05);绘制ROC曲线图,结果显示,FOXK1阳性、SPON2阳性预测胃癌患者预后的AUC分别为0.805、0.803,均>0.80,有一定预测价值。结论胃癌患者预后不良可能与组织中FOXK1、SPON2阳性表达有关,二者阳性表达可能是胃癌患者的风险因子。

肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白表达变化及意义

目的观察肺癌组织中叉头框K1(FOXK1)、脊椎蛋白2(SPON2)蛋白表达变化,并探讨其临床意义。方法收集手术切除的81例肺癌及其癌旁组织标本,用免疫组化法检测组织中FOXK1与SPON2蛋白表达,用Spearman等级相关分析FOXK1与SPON2蛋白表达的相关性,分析FOXK1与SPON2蛋白阳性表达与患者临床病理参数及预后的关系。结果肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白阳性表达率均高于癌旁组织(P均<0. 05)。肺癌组织中FOXK1蛋白阳性表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0. 05),而与患者性别、年龄及肿瘤病理类型、分化程度、大小无关(P均> 0. 05); SPON2蛋白阳性表达与肿瘤病理类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0. 05),而与患者性别、年龄、肿瘤大小无关(P均> 0. 05)。肺癌组织中FOXK1与SPON2的蛋白表达呈正相关(r=0. 588,P=0. 000)。肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白阳性表达患者的无进展生存率、无进展生存期均低于阴性表达患者(P均<0. 05)。结论肺癌组织中FOXK1、SPON2蛋白均呈高表达,二者可能协同参与了肺癌的发生发展,影响患者预后。

MACC1、SPON2在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨结肠癌转移相关基因1(metastasis associated in colon cancer 1,MACC1)、脊椎蛋白2(spondin 2,SPON2)在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法收集2013年1月至2015年1月于本院行胃癌根治术的106例胃癌患者癌组织、90例癌旁正常胃黏膜组织以及内镜下摘取的83例胃息肉组织。采用免疫组化法检测MACC1、SPON2蛋白表达情况。Cox比例风险回归分析影响胃癌预后的因素。结果MACC1、SPON2蛋白在胃癌组织的阳性表达率均高于胃息肉组织及癌旁正常胃黏膜组织(均P<0.05)。胃癌组织中MACC1、SPON2表达水平均与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润程度及淋巴结转移有关(均P<0.05)。MACC1蛋白高表达组和低表达组中位总生存时间分别为23个月和34个月(log-rankχ^(2)=9.324,P=0.002);SPON2蛋白高表达组和低表达组中位总生存时间分别为25个月和34个月(log-rankχ^(2)=4.694,P=0.030)。多因素分析结果显示,MACC1及SPON2蛋白高表达是胃癌患者预后不良的危险因素(均P<0.05)。结论MACC1、SPON2在胃癌组织中高表达,两者高表达均是胃癌患者预后不良的因素。

RSPO2过表达人肝星状细胞株LX-2中差异表达蛋白的筛选及生物学功能分析

目的 筛选特异性顶部盘状底板反应蛋白2(RSPO2)在人肝星状细胞株LX-2中过表达后的差异表达蛋白,并进行差异表达蛋白的生物学功能分析。方法 通过分子生物学手段构建RSPO2过表达载体并转染进人肝星状细胞,利用RT-PCR验证RSPO2的过表达状态,细胞划痕实验观察过表达RSPO2肝星状细胞的生长及迁移能力。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术检测RSPO2过表达人肝星状细胞和正常人肝星状细胞的差异表达蛋白,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果 通过RT-PCR验证,在人肝星状细胞株LX-2中成功过表达了RSPO2蛋白;通过LC-MS/MS技术对比RSPO2过表达肝星状细胞和正常肝星状细胞,获得候选差异表达蛋白共计233个,其中115个蛋白在RSPO2过表达细胞中表达下调,118个表达上调,这些差异表达蛋白参与了很多与细胞转录、复制、增殖相关的信号通路。结论 RSPO2过表达LX-2细胞差异表达蛋白共计233个,其中115个蛋白在RSPO2过表达细胞中表达下调,118个表达上调,这些差异表达蛋白大多参与到RNA的转录与翻译过程。

脊椎蛋白2在胃癌中的表达及临床意义

目的检测脊椎蛋白2(SPON2)在胃癌细胞、组织及血清中的表达,探讨在胃癌中的价值。方法检测胃癌细胞株BGC-823、MGC-803、SGC-7901及正常胃黏膜细胞GES-1中SPON2蛋白表达情况;检测2013年1月至2015年9月解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科存档的120例胃癌及相应癌旁蜡块组织中SPON2的表达;检测2019年5月至2020年9月70例胃癌患者、60例慢性萎缩性胃炎患者、60名健康体检者的血清中SPON2、癌胚抗原(CEA)及糖类抗原19-9(Ca19-9)的表达水平。结果各胃癌细胞株中SPON2的表达水平均高于正常胃黏膜细胞GES-1(P<0.05)。SPON2在胃癌组织中阳性率高于癌旁正常组织(P<0.05)。多因素生存分析提示SPON2是判断胃癌预后的独立危险因素(OR=0.712,95%CI:0.431~0.978,P<0.05)。胃癌患者血清SPON2的相对表达量均高于慢性萎缩性胃炎患者和健康体检者(P<0.05)。血清SPON2、CEA、Ca19-9联合检测曲线下面积与单独检测差异有统计学意义(P<0.05)。结论SPON2蛋白可能参与胃癌的发生、发展;血清SPON2、CEA、Ca19-9联合检测有利于提升胃癌的诊断。

Spondin-2基因沉默对人结直肠癌SW480细胞的侵袭及上皮-间充质转化能力的影响

目的探讨Spondin-2(SPON2)基因沉默对人结直肠癌SW480细胞侵袭及上皮-间充质转化(EMT)能力的影响。方法体外培养人结直肠癌SW480细胞, 对细胞进行慢病毒转染, 并将细胞分为对照组、阴性转染组和shSPON2转染组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测各组细胞中Spondin-2 mRNA的表达;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测培养24、48、72 h后各组细胞增殖情况, Transwell法检测培养48 h后各组细胞侵袭情况;蛋白免疫印迹法检测培养48 h后各组细胞中蛋白细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、pERK1/2、含ETS域蛋白1(ELK-1)、pELK-1及EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达。研究数据采用单因素方差分析进行比较。结果 shSPON2转染组SPON2 mRNA表达水平(0.43±0.04)低于对照组(1.00±0.05, t=21.805, P<0.05), 低于阴性转染组(0.97±0.03, t=26.454, P<0.05)。培养24、48、72 h后, 3组间同一时间吸光度(A)值比较, 差异有统计学意义(F=27.982、31.052、28.484, P<0.05)。同一时间下, 与对照组比较, shSPON2转染组细胞A值降低, 且低于阴性转染组(P<0.05)。shSPON2转染组SW480细胞侵袭数目[(55.93±11.24)个]低于对照组[(118.75±19.61)个, t=6.808, P<0.05], 低于阴性转染组[(105.87±15.36)个, t=6.427, P<0.05]。3组间SW480细胞蛋白pERK1/2、pELK-1表达水平比较, 差异有统计学意义(F=357.899、339.313, P<0.05)。与对照组比较, shSPON2转染组细胞蛋白pERK1/2、pELK-1表达降低, 且低于阴性转染组(P<0.05)。3组间E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平比较, 差异有统计学意义(F=316.867、533.522、416.446, P<0.05)。与对照组比较, shSPON2转染组细胞蛋白E-cadherin表达升高, N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)。结论 SPON2基因沉默能够抑制SW480细胞增殖、侵袭, 抑制EMT过程, 可能与ERK/ELK-1信号通路的抑制有关。

信迪利单抗联合卡铂全身化疗用于宫颈癌复发转移患者的效果

目的:观察信迪利单抗联合卡铂全身化疗用于宫颈癌复发转移患者的效果。方法:选取2020年1月至2023年1月该院收治的68例宫颈癌复发转移患者进行前瞻性研究,按照随机数字表法将其分为对照组和研究组各34例。对照组采用卡铂全身化疗,研究组在对照组基础上联合信迪利单抗治疗,比较两组客观缓解率(ORR),治疗前后成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、脊椎蛋白2(SPON2)、癌胚抗原(CEA)水平、体征状态[卡氏(KPS)]评分,以及不良反应发生率和无进展生存期。结果:研究组ORR为85.29%(29/34),高于对照组的61.76%(21/34),差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,研究组血清FGFR4、SPON2和CEA水平均低于对照组,KPS评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05);研究组无进展生存期长于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:信迪利单抗联合卡铂全身化疗用于宫颈癌复发转移患者可提高ORR和KPS评分,降低血清FGFR4、SPON2和CEA水平,延长无进展生存期,效果优于单纯卡铂全身化疗。

紫杉醇联合顺铂治疗宫颈癌的临床疗效及对患者免疫功能的影响

目的探讨紫杉醇联合顺铂治疗宫颈癌的临床疗效及对患者免疫功能的影响。方法根据治疗方法的不同将70例宫颈癌患者分为A组(n=35,给予顺铂治疗)和B组(n=35,给予紫杉醇联合顺铂治疗)。比较两组患者的近期疗效、血清肿瘤标志物[鳞状细胞癌抗原(SCCA)、脊椎蛋白2(SPON2)、肿瘤特异性生长因子(TSGF)]水平、免疫功能指标(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+))及不良反应发生情况。结果B组患者的客观缓解率和疾病控制率分别为74.29%和94.29%,分别高于A组患者的48.57%和77.14%,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。治疗后,两组患者血清SCCA、SPON2、TSGF水平均低于本组治疗前,B组患者血清SCCA、SPON2、TSGF水平均低于A组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。治疗后,两组患者CD3^(+)、CD4^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均高于本组治疗前,CD8^(+)水平均低于本组治疗前,B组患者CD3^(+)、CD4^(+)水平及CD4^(+)/CD8^(+)均高于A组,CD8^(+)水平低于A组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。两组患者的不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论紫杉醇联合顺铂治疗宫颈癌的疗效确切,可降低血清肿瘤标志物水平,改善免疫功能,且具有一定的安全性。

不同肿瘤标志物在前列腺癌中的诊断价值

目的探讨不同肿瘤标志物在前列腺癌中的诊断价值。方法选取2013年6月至2016年12月拟诊断前列腺癌的患者共76例，对患者进行穿刺活检确诊后，分为前列腺癌组（26例）和非前列腺癌对照组（50例），采用ELISA方法检测两组患者血清中PSA、PSMA、Spondin-2含量，并评价各指标与前列腺癌发的相关性，以及对前列腺癌的诊断效果。结果前列腺癌组和非前列腺癌对照组患者血清中PSA、PSMA、Spondin-2的含量具有显著性差异（P〈0．01）；PSA、PSMAS及Spondin-2分别与前列腺癌发生均呈正相关（r=0．306，r=0．499，r=0．299），且LPSMA的诊断敏感性和特异性最高，分别达到80．8％和60．0％。结论PSMA有助于提高前列腺癌诊断敏感性及特异性，具有重要的诊断价值。

Mindin生物学功能研究新进展

Mindin又称Spondin2,是一种分泌型细胞外基质蛋白,属于Mindin-F-spondin细胞外基质蛋白家族成员之一,Mindin广泛表达于哺乳动物的各组织。最近的研究揭示了Mindin作为细胞外基质在介导炎症细胞的招募,炎症反应的应答,肝脏、脑急性损伤中细胞凋亡作用;也显示了Mindin在心脏肥大、纤维化,肥胖相关的脂肪肝、炎症反应、胰岛素抵抗方面的保护作用;同时Mindin表现出成为反应糖尿病肾病进程,预测前列腺癌的生物学指标等方面的潜力。本文将对Mindin的生物学功能研究进展进行阐述。

Spondin-2和c-Myc在肺腺癌中的表达及其与预后的关系

目的 :探讨Spondin-2和c-Myc在肺腺癌中的表达及其与预后的关系。方法 :选取60例肺腺癌组织标本,非肿瘤性肺组织60例作为对照。应用免疫组化法检测Spondin-2和c-Myc的表达,并分析二者的表达与肺腺癌患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移以及患者预后的关系。结果 :Spondin-2在60例肺腺癌组织中阳性表达率为83.33%(50/60),在正常肺组织中阳性表达率为51.67%(31/60),二者有统计学差异。肺腺癌中Spondin-2的表达与组织学分级相关,差异有统计学意义,与发病年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移无显著相关。c-Myc在60例肺腺癌组织中阳性表达率为68.33%(41/60),在肺腺癌组织中阳性表达率为31.67%(19/60),二者有统计学差异。肺腺癌病人c-Myc的表达与组织学分级、淋巴结转移有相关性,差异均有统计学意义,与性别、发病年龄、肿瘤大小无显著相关性。肺腺癌患者Spondin-2阳性表达与c-Myc阳性表达呈正相关性。生存分析显示,Spondin-2和c-Myc表达阴性组患者的无瘤生存率均明显高于其阳性组,差异均有统计学意义。结论 :Spondin-2和c-Myc在肺腺癌中呈高表达,且表达水平均与组织学分级有相关性,c-Myc也与淋巴结转移有关。二者阳性反映肺腺癌预后差。

FOXO6和SPON2表达水平与胃癌患者疾病进展和预后的关系分析

[目的]探讨叉头转录因子6(FOXO6)和脊椎蛋白2(SPON2)表达水平与胃癌患者疾病进展和预后的关系。[方法]选取165例胃癌患者,通过免疫组织化学法检测胃癌及癌旁正常组织标本中FOXO6、SPON2和基质金属肽酶-9(MMP-9)的表达水平。统计分析胃癌中FOXO6、SPON2表达水平与MMP-9、临床病理因素及预后价值之间的相关性。[结果]在165例胃癌组织中,FOXO6和SPON2染色分别位于胃癌细胞核和细胞质中。二者过表达与浸润深度(均P<0.001)、淋巴结转移(均P<0.001)及疾病阶段(P<0.001)显著相关。此外,在单变量和多变量分析中,FOXO6和SPON2是总生存(分别为HR=3.156,95%CI 2.176~4.895,P<0.001;HR=1.654,95%CI1.016~2.635,P=0.016)和无复发生存(分别为HR=3.156,95%CI 2.176~4.895,P<0.001;HR=1.654,95%CI 1.016~2.635,P=0.016)的独立预后因素。[结论]FOXO6和SPON2可能在胃癌的肿瘤浸润、转移和预后中起重要作用,并且可能成为预测预后的新靶标。

脊椎蛋白2对BMSCs成骨分化及卵巢去势小鼠骨代谢的作用研究

目的探讨脊椎蛋白2(R-spondin 2,Rspo2)对BMSCs成骨分化及卵巢去势(ovariectomy,OVX)小鼠骨密度和骨矿含量的影响。方法取7只4周龄雌性C57BL/6小鼠长骨骨髓,采用全骨髓培养法分离培养BMSCs并传代,经流式细胞仪鉴定细胞表型后,取第3代细胞与10、20、40、80和100 nmol/L Rspo2共培养,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖,评价Rspo2对BMSCs活性影响并筛选不影响细胞活性的Rspo2干预浓度;与不同筛选浓度Rspo2培养后更换为成骨诱导培养基诱导培养,行ALP及实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测RUNX家族转录因子2(RUNX family transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠalpha 1,Col1)、骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达,评价Rspo2对BMSCs成骨能力的影响;以上检测均以正常培养BMSCs作为对照。另取18只10周龄雌性C57BL/6小鼠,随机分为假手术组、OVX组和OVX+Rspo2组,每组6只。假手术组仅行双侧背部切开缝合,其余两组通过双侧OVX建立骨质疏松模型;术后OVX+Rspo2组每周腹腔注射Rspo2(1 mg/kg),其余两组接受相同剂量生理盐水。干预12周后,3组称重小鼠体质量及子宫质量,评估OVX模型制备是否成功;取胫骨行HE染色观察骨量变化、免疫组织化学染色观察骨组织中Runx2蛋白表达水平;ELISA法检测血清中骨代谢标记物[ALP、OCN、Ⅰ型前胶原氨基端肽(typeⅠprocollagen amino-terminal peptide,PINP)]和骨吸收标记物[β胶原降解产物(β-isomerized C-telopeptide,β-CTX)]表达水平;Micro-CT检测胫骨微结构变化,并对骨小梁厚度(trabeculae thickness,Tb.Th)、骨小梁数量(trabeculae number,Tb.N)、骨小梁分离度(trabeculae separation,Tb.Sp)和骨体积分数(bone volume fraction,BV/TV)进行三维组织形态计量分析。结果CCK-8检测示80 nmol/L以下浓度的Rspo2不会产生细胞毒性(P>0.05),且20 nmol/L Rspo2组细胞活力明显高于对照组(P<0.05)。基于上述结果,选择10、20和40 nmol/L Rspo2进行后续实验。ALP染色示,各浓度Rspo2组阳性细胞面积明显大于对照组,其中20 nmol/L Rspo2组最高,组间差异均有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR检测成骨相关基因Runx2、Col1和OCN mRNA表达水平均较对照组提高,除40 nmol/L Rspo2组Runx2外,各组相关指标与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。动物实验中各组小鼠术后均存活至实验完成,且干预12周后小鼠体质量及子宫质量结果示OVX模型制备成功。组织学及免疫组织化学染色示,OVX组小鼠骨小梁疏松程度、连接性以及Runx2表达均低于假手术组,而OVX+Rspo2组经Rspo2处理后均较OVX组逆转,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测示OVX组小鼠血清中骨代谢标记物与假手术组相比,ALP表达升高、PINP表达下降(P<0.05);Rspo2干预后,PINP表达逆转显著增高,与假手术组及OVX组差异均有统计学意义(P<0.05)。OXV组骨吸收标记物β-CTX高于假手术组(P<0.05),OVX+Rspo2组较OVX组明显下降(P<0.05)。Micro-CT检测示,与假手术组相比,OVX组Tb.Th、Tb.N和BV/TV降低,而Tb.Sp增高(P<0.05);经Rspo2干预后,除Tb.Th外OVX+Rspo2组上述指标均得到改善(P<0.05)。结论Rspo2能够促进BMSCs向成骨细胞分化,改善小鼠由于雌激素缺乏导致的骨质疏松,促进骨形成。