伊曲康唑联合卡泊芬净或特比萘芬对球形孢子丝菌体外抑菌作用的研究

目的探讨伊曲康唑联合卡泊芬净或特比萘芬时对球形孢子丝菌酵母相和菌丝相的体外抑菌作用。方法参照标准的微量液基稀释法及棋盘微量稀释法对33株球形孢子丝菌行药敏试验,结果使用抑菌浓度指数(FICI)判定"协同""不相关"和"拮抗"。结果伊曲康唑与卡泊芬净联合对球形孢子丝菌酵母相菌株的协同率为93.94%(31/33),与特比萘芬联合的协同率为60.61%(20/33);伊曲康唑与卡泊芬净或特比萘芬联合对菌丝相菌株协同率分别为96.97%(32/33)、84.5%(28/33)。对所有受试菌株均未观察到上述药物的拮抗作用。结论体外联合药敏试验结果显示伊曲康唑与卡泊芬净或特比萘芬联合有较好的协同作用。

中国南北方地区临床孢子丝菌菌种鉴定

目的对分离自我国南、北方地区50株临床孢子丝菌进行菌种鉴定。方法分离菌株分别进行25℃恒温培养和玻片小培养,肉眼和镜下观察形态特征;同时提取菌丝相基因组DNA,用PCR分别扩增部分微管蛋白(β-tubulin)基因和核糖体内部转录间隔区(Ribosomal Internal Transcribed Spacer,ITS),扩增产物进行测序,并采用最大似然法(maximum likelihood,ML)和邻接法(neighbor-joining,NJ)构建联合β-tubulin基因和ITS区域的系统发育树。结果结合形态学及系统发育分析,50株菌均鉴定为球形孢子丝菌(Sporothrix globosa,S.globosa)。结论球形孢子丝菌是目前我国南、北方地区孢子丝菌病的主要致病菌种,为进一步明确我国孢子丝菌病致病菌种的分布提供了依据。

球形孢子丝菌DNA提取方法的比较

目的获得一种高效、快速、简便的提取球形孢子丝菌DNA的方法。方法以不同地区来源的球形孢子丝菌为实验材料,采用CTAB法、异硫氰酸胍法、试剂盒法、碱裂解法4种方法分别提取球形孢子丝菌DNA。通过紫外吸光度法测定DNA的浓度和纯度,琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增评价DNA的质量。结果虽然不同方法均可得到球形孢子丝菌的DNA,但碱裂解法获得DNA的浓度和纯度明显优于其他3种方法。利用钙调蛋白基因的引物对DNA进行PCR扩增后,各样本均出现阳性条带,且条带亮度较好。结论碱裂解法是获得高质量球形孢子丝菌DNA的理想方法。

球形孢子丝菌黑素抵御抗真菌药物杀伤作用的研究

目的探讨球形孢子丝菌黑素对抗真菌药特比萘芬(TRB)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)和两性霉素B(AMB)的作用。方法利用琼脂平板涂布法比较球形孢子丝菌黑素野生株(MEL+)与白化突变株(MEL-)对抗真菌药物的敏感性;利用紫外分光光度法,检测黑素对抗真菌药浓度的影响;利用HPLC法,分析黑素对抗真菌药的作用机制。结果药敏结果显示,在AMB的(4~16)μg/mL和ICZ的(0.06~0.25)μg/mL浓度间,MEL-生存率显著低于MEL+;紫外分光光度法检测显示,黑素可以显著降低AMB的浓度(P<0.01);HPLC图谱显示,黑素加入后AMB出现新峰。结论球形孢子丝菌黑素能够抵御AMB和ICZ对菌株的杀伤,并提示黑素可能对AMB进行转化,从而降低药物浓度。

球形孢子丝菌致婴儿固定型孢子丝菌病1例及相关实验研究

报道1例由球形孢子丝菌所致的婴儿固定型孢子丝菌病。患儿女,3个月,因左眼下内侧皮损2个月就诊,皮损脓液标本进行真菌培养,对培养获得菌株进行形态学、生理学和分子生物学鉴定,并进行药物敏感性检测。真菌培养阳性,镜下可见典型的套袖样菌丝。钙调蛋白基因序列分析鉴定为球形孢子丝菌。药敏试验显示特比萘芬和伊曲康唑对该菌株的菌丝相最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)分别为0.5μg/mL和0.5μg/mL;对该菌株的酵母相的MIC值分别为0.25μg/mL和0.5μg/mL。给予患者口服特比萘芬32.5 mg/d治疗10周后皮损消退呈瘢痕化修复。依据临床及实验室检查确诊该病例为球形孢子丝菌所致固定型孢子丝菌病,特比萘芬治疗本病例显示较好疗效。

中国临床球形孢子丝菌菌丝相药物敏感性分析

目的检测我国临床球形孢子丝菌菌丝相对5种抗真菌药物的体外敏感性,同时对比我国不同地区菌株药物敏感性的差异。方法将重庆、吉林、北京地区既往基因鉴定为球形孢子丝菌的100株临床菌株接种于2%马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上,25℃恒温培养7d获得菌丝相。依据美国临床与实验室标准化委员会(CLSI)制定的M38-A2方案,采用微量液基稀释法检测菌丝相对碘化钾、伊曲康唑、特比萘芬、氟康唑、两性霉素B的体外最低抑菌浓度(MIC)。质控菌株为近平滑念菌ATCC22019。结果碘化钾体外无抗真菌活性,特比萘芬MIC几何均值为0.14μg/mL,伊曲康唑和两性霉素B MIC几何均值分别为0.79μg/mL和0.63μg/mL,氟康唑MIC几何均值为45.89μg/mL。发现7株对伊曲康唑耐药菌株,吉林地区相对较多,但不同地区菌株的药物MIC值差异无统计学意义(P>0.05)。结论碘化钾无体外抗真菌活性,我国临床球形孢子丝菌对特比萘芬最敏感,其次为伊曲康唑和两性霉素B,对氟康唑敏感性最差,不同地区菌株对抗真菌药物的敏感性没有明显差异。

球形孢子丝菌刺激小鼠树突状细胞表达前炎症细胞因子的研究

目的本研究旨在观察分离于新疆的球形孢子丝菌临床株刺激小鼠树突状细胞(Dendritic cells,DCs)后不同炎症因子分泌表达的特征,初步预测这些炎症因子的功能。方法菌株来源于淋巴管型孢子丝菌病患者。将该菌配置成不同浓度的菌悬液(1×10^4个/mL^1×10^7个/mL),刺激小鼠DC(细胞悬浮液浓度1×10^6细胞/mL),分别收集6 h、24 h、48 h、72 h时细胞培养上清液,采用酶免法检测IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、IFN-γ的含量表达。结果以最低浓度菌液(1×10^4个/mL)刺激DC,被刺激后的DC分泌了IL-1β、IL-6和TNF-α,不同时间点分泌量分别为:IL-1β(6 h:21.26±3.03;24 h:24.04±4.25;48 h:24.90±4.31;72 h:27.29±6.09)、IL-6(6 h:44.38±3.73;24 h:101.72±12.28;48 h:133.10±8.67;72 h:180.38±13.84)、TNF-α(6 h:860.36±20.64;24 h:356.03±11.46;48 h:457.43±17.39;72 h:1454.53±19.46),但是IFN-γ和IL-4未见分泌表达。IL-1β和IL-6分泌水平有随时间和剂量依赖而逐渐增高,但是TNF-α释放量呈现不规律表达。结论 DC参与了球形孢子丝菌感染的天然免疫应答,分泌的关键炎症因子是IL-1β、IL-6、和TNF-α,表达量为TNF-α> IL-6> IL-1β。其中IL-1β和IL-6分泌表达量具有时间和剂量依赖性。

10种中药单体对球形孢子丝菌的体外抗真菌作用研究

目的观察10种中药单体对球形孢子丝菌体外抑菌效果。方法参照CLSI的制M38-A2(3rd),采用微量液基稀释法,检测10种中药单体对20株球形孢子丝菌的作用。结果10种中药单体最小抑菌浓度(MIC)的几何均数范围为53.82μg/mL~>1024μg/mL,大蒜素、小檗碱、苦参碱、蛇床子素和丹皮酚的抑菌活性最佳,几何均数分别依次为53.82μg/mL、84.45μg/mL、103.97μg/mL、137.19μg/mL和284.05μg/mL,大蒜素的抗菌作用最强,MIC的范围为16~128μg/mL。最小杀菌浓度(MFC)的范围为64μg/mL~>1024μg/mL。大蒜素的MFC值最低,几何均数为415.87μg/mL。结论大蒜素、小檗碱、苦参碱、蛇床子素和丹皮酚对球形孢子丝菌具有一定的抑菌活性,不同中药单体抑菌活性存在差异。

耳部孢子丝菌病1例

患者男,40岁。右耳起疹1年余。皮肤科情况:右侧耳轮至耳垂见多数米粒至绿豆大小暗红色丘疹,部分覆红褐色薄痂,表面轻度脱屑,耳垂部皮肤轻度肿胀。经组织病理检查、真菌培养及分子生物学鉴定,诊断:孢子丝菌病。予10%碘化钾口服治疗1个月,皮疹基本消退。目前仍在随访中。

萎缩型皮肤表现孢子丝菌病1例

患者,男,50岁,因“左前胸群集分布萎缩性斑片、丘疹1年半”就诊。既往于当地医院诊断为带状疱疹,间断治疗(具体不详),病情未明显好转。皮肤科检查:左前胸多个轻度萎缩性暗红斑片,米粒至黄豆大小暗红丘疹。皮损组织病理检查:棘层不规则增厚,真皮浅中层有大量淋巴细胞和浆细胞浸润,提示炎性肉芽肿改变。PAS染色可见圆形孢子。皮损组织沙堡弱培养基培养出深褐色绒毛状菌落,琼脂小培养并乳酸酚棉兰染色见细长分隔分枝菌丝和分生孢子,根据其表型特征可被鉴定为广义申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii sensu lato),通过DNA测序鉴定该菌株为球形孢子丝菌(Sporothrix globosa),诊断为孢子丝菌病。口服伊曲康唑200 mg/d治疗4个月,症状消退,维持用药2~4周,6个月后随访无复发。

Molecular identification of Sporothrix clinical isolates in China

研究目的:明确中国地区孢子丝菌病的致病菌种。创新要点:构建中国地区临床孢子丝菌系统进化树,用分子生物学方法对致病菌种进行重新鉴定。研究方法:多基因测序和系统发育分析。重要结论:球形孢子丝菌可能为中国地区孢子丝菌病的主要病原菌,申克孢子丝菌在中国地区是否存在尚需进一步验证。

球形孢子丝菌亲环素B的功能和定位研究

目的研究球形孢子丝菌亲环素B(CypB)的抗原性、免疫原性以及亚细胞定位。方法通过生物信息学方法从球形孢子丝菌基因组数据库中鉴定出CypB基因(Sg.CypB)及其蛋白(Sg.CypB)。通过原核表达的方法表达出重组Sg.CypB(r Sg.CypB)。将纯化的重组蛋白免疫SD大鼠获得抗r Sg.CypB抗体,用ELISA法检测获得的抗体滴度。用获得的抗体对球形孢子丝菌行免疫荧光染色,观察Sg.CypB在球形孢子丝菌上的分布。结果Sg.CypB基因长930 bp,编码的Sg.CypB含有309个氨基酸。预测Sg.CypB具有分泌信号肽和C端跨膜序列,蛋白主体部位位于细胞外,具有典型的肽基脯氨酸顺反异构酶(PPIase)活性,且能检测出原核表达的r Sg.CypB具有PPIase活性。利用大鼠产生的抗r Sg.CypB抗体(滴度达到1∶51200,P<0.05),免疫荧光检测到Sg.CypB位于球形孢子丝菌表面。结论Sg.CypB是位于球形孢子丝菌表面的具有PPIase活性的抗原分子,可能在真菌-宿主相互作用中发挥作用。

来自中国北方部分地区33株孢子丝菌菌株的表型和基因型鉴定

孢子丝菌病是一种临床常见的真菌感染疾病,近期有研究认为其致病菌是由多个同形种构成的复合体。为明确我国孢子丝菌病致病菌的生理学以及分子生物学方面的特点,对33株分离自我国孢子丝菌病患者组织的病原菌进行了研究,首先检测其在37℃是否生长以及PDA培养基上生长21d的菌落直径,其次检测其糖同化特点,最后对其钙调蛋白(Calmodulin,CAL)基因进行PCR扩增、序列测定以及系统进化分析。结果显示,这些菌株全部为球形孢子丝菌Sporothrix globosa,说明我国孢子丝菌病的病原菌可能以球形孢子丝菌为主。

皮肤淋巴管型孢子丝菌病1例

患者男,48岁,菜农。右侧手背及前臂红色丘疹、结节,不伴痛痒1月余。发病前有外伤史。皮肤科情况:右侧手背及前臂可见数个红色丘疹、结节和溃疡,呈线状分布。真菌直接镜检阴性;真菌培养见孢子丝菌复合体生长。组织病理呈感染性肉芽肿改变。扫描电镜可见分生孢子梗侧生或顶生分生孢子;全壁芽生孢子在基底部产生横隔,脱落后遗留有齿状突起。分子生物学、构建系统发育进化树鉴定结果为球形孢子丝菌。给予患者口服伊曲康唑联合特比萘芬,外用卢立康唑乳膏,治疗2个月后明显好转。

球形孢子丝菌vps34基因序列的获得及其在双相型表达差异的初探

目的获得球形孢子丝菌液泡分选蛋白34(vacuolar protein sorting 34,Vps34)编码基因全长序列,并探讨vps34基因在球形孢子丝菌(Sporothrix globosa)由菌丝相向酵母相转换中的作用。方法利用快速扩增cDNA末端技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法分别扩增球形孢子丝菌vps34基因3′端和5′端序列,序列拼接后进行生物信息分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析vps34基因在菌丝相和酵母相的表达差异。结果球形孢子丝菌vps34基因全长共3 228bp,其中CDS区长度为3000bp,编码999个氨基酸,相对分子质量(Mr)为111.49×10^3,等电点为6.38,包含C2_PI3K_class_Ⅲ、PI3Ka_Ⅲ、PI3Kc_Ⅲ共3个结构域;qRT-PCR检测结果显示,24h时,球形孢子丝菌酵母相的vps34表达量高于菌丝相(P<0.05),48h时差异最大(P<0.01)。结论vps34基因参与了球形孢子丝菌双相型转换的过程,而球形孢子丝菌vps34基因全长的获得为进一步研究Vps34p的功能提供实验资料。

皮肤固定型孢子丝菌病1例及其相关实验检查

患者男,50岁。左上臂皮肤溃疡2年。皮损组织病理示:炎性肉芽肿改变,PAS染色可见圆形孢子和星状体。皮损真菌培养阳性,菌种鉴定为球形孢子丝菌。确诊为皮肤固定型孢子丝菌病,给予患者口服伊曲康唑和特比萘芬联合治疗3个月,皮损部分改善。之后患者间断口服特比萘芬联合碘化钾治疗,一年半后复诊仍有局灶性皮损未愈。

中国球形孢子丝菌双相cDNA消减文库构建及其差异基因的筛选和验证(英文)

目的:为进一步研究中国球形孢子丝菌的双向转换机制,明确目的差异基因对我国球形孢子丝菌形态和双相转换的影响,探讨可能参与的信号传导通路,以期较全面地探讨孢子丝菌双相转换相关的分子机制,也为筛选抗真菌药物研究提供新的靶位和切入点。创新点:以中国球形孢子丝菌双向转换为立足点,应用抑制性消减文库成功构建的高特异性的中国球形孢子丝菌酵母相(Y)和菌丝相(M)的正反cDNA基础上,对中国球形孢子丝菌双相转换相关基因进行生物信息学分析并对部分有意义的差异表达基因进行验证。方法:本实验通过抑制性消减杂交技术构建中国球形孢子丝菌酵母相和菌丝相的正反cDNA消减文库,并对差异基因进行生物信息学分析,获得部分有意义的差异表达基因,再通过实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术验证目的基因在双相中的差异表达。结论:通过抑制性消减杂交技术对中国球形孢子丝菌的正向和反向两个文库进行筛选,获得可能参与球形孢子丝菌细胞壁合成、信号转到、新陈代谢类等相关的片段重叠群(contigs),结果表明中国球形孢子丝菌在双相型转换中存在明显表达差异基因,同时利用相对定量的实时荧光定量技术对其中两个基因(细胞表面分子类基因细胞周期检测点激酶CHK和结构基因类核糖体RNA基因)进行验证,认为它们可能与双相转换有关。

申克孢子丝菌复合体在形态学和生理生化的研究(英文)

目的:研究申克孢子丝菌复合体在形态学、糖同化和抗真菌药物敏感性的差异,探讨不同种类孢子丝菌的形态、生理生化及抗真菌药物敏感的特性。创新点:首次对我国球形孢子丝菌与其它孢子丝菌模式菌株在形态学、生理生化和抗真菌药敏方面进行比较,从而找出我国孢子丝菌与模式菌株的差异和相同点。方法:实验选用15株从我国三个不同地区分离的球形孢子丝菌和11株购买的孢子丝菌模式菌株(表1),将这26株孢子丝菌菌株分别接种到2%的马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上,通过在不同时间段观察菌落生长特征,测量菌落直径,镜下观察菌丝、孢子形态,测定最小抑制浓度(MIC)并进行评价。结论:实验显示:根据顶端分生孢子的形态(图2)、不同时期菌种的菌落直径(图1)、糖同化实验(表2和表3)可进行简单鉴定我国球形孢子丝菌与孢子丝菌复合体;特比萘芬有较好的体外抑菌活性,而碘化钾、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B对不同的菌株的抗菌敏感性不同(表4)。综上所述,我国孢子丝菌临床菌株与孢子丝菌复合体在表型、生理生化及体外抗真菌药物敏感性上均有不同程度的差异。