新疆地区扇头蜱中Candidatus Rickettsia barbariae的检测与序列分析

为了解新疆地区血红扇头蜱和图兰扇头蜱中Candidatus Rickettsia barbariae立克次体感染状况,从新疆尉犁县采集蜱标本510只,其中血红扇头蜱90只,图兰扇头蜱420只。利用PCR方法对C.R.barbariae立克次体ompA、ompB、glt A和17k Da基因片段进行扩增。10只血红扇头蜱和53只图兰扇头蜱检测出C.R.barbariae阳性,阳性率分别为11.11%和12.62%。经序列分析,同一目的基因阳性序列相同,为同一序列。经比对分析,ompA基因序列与意大利撒丁岛的图兰扇头蜱中检测出的C.R.barbariae序列(EU272186.1)同源性为99.8%(583/584)。所测得ompB基因序列与意大利撒丁岛图兰扇头蜱中检测出的的C.R.barbariae Omp B基因序列(EU272187.1)同源性达100%(768/768)。所测得的glt A基因序列、17k Da基因序列与新疆花蠕形蚤Vermipsylla alakurt检测出的相应基因序列(KT284716.1、KT284715.1)同源性达100%(375/375、356/356)。结果表明,新疆尉犁县地区血红扇头蜱和图兰扇头蜱中存在C.R.barbariae自然感染,感染率较高。

一只流浪犬体表寄生蜱的种类鉴定及其携带病原体的检测与分析

【目的】鉴定一只来自浙江嘉兴的流浪犬体表寄生的蜱种类及其携带病原体情况,了解血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)的生活史及其携带的病原体对人和动物的危害,为后续防治相关疾病提供措施。【方法】分别采用光学显微镜观察和PCR方法对蜱进行形态学和分子种类鉴定;同时分别针对梨形虫目和巴贝斯虫属的18S rRNA、斑点热群立克次氏体ompA、埃立希体dsb和伯氏疏螺旋体5S~23S rRNA基因进行PCR扩增,检测蜱携带病原体情况。【结果】从该流浪犬体表采集的82只蜱均为血红扇头蜱,其中24只蜱携带泰勒虫属,阳性率为29.27%(24/82);4只携带Colpodella sp.,阳性率为4.88%(4/82);2只携带巴贝斯虫属,阳性率为2.44%(2/82);21只携带斑点热群立克次氏体,阳性率为25.61%(21/82);15只携带埃立希体,阳性率为18.29%(15/82);未发现有蜱携带伯氏疏螺旋体。在单只蜱中检出的病原体数量和种类都各不同,其中有24只蜱仅携带1种病原体;12只蜱同时携带2种病原体;6只蜱同时携带3种病原体;有40只蜱未携带所检病原体。【结论】该流浪犬体表寄生的蜱为血红扇头蜱,其携带了泰勒虫属、巴贝斯虫属、斑点热群立克次氏体、埃立希体多种病原体,可对人和动物造成较大的威胁,应加强对该地区蜱的防控,尤其是加强对流浪犬的管理。

新疆蜱类携带斑点热群立克次体的调查研究

目的对新疆蜱类携带斑点热群立克次体情况进行调查,为新疆地区蜱媒病防治提供技术支撑。方法使用家畜体表法和布旗法采集蜱类,使用聚合酶链式反应(PCR)检测立克次体外膜蛋白A(ompA)基因片段。结果使用家畜体表采集法和布旗法共采集7105只成年蜱样本,经形态学鉴定共7属12种。其中,3650只(51.4%)进行外膜蛋白A基因片段的聚合酶链式反应(PCR)检测立克次体核酸,共检测出8种斑点热群立克次体。从和硕、尉犁、玛纳斯和霍城地区采集的扇头蜱Rhipicephalus、璃眼蜱Hyalomma和血蜱Haemaphysalis中均检测出Candidatus R.barbariae立克次体、从和硕、尉犁、玛纳斯地区采集的扇头蜱Rhipicephalus和璃眼蜱Hyalomma中均检测出康氏立克次体Rickettsia conorii;从玛纳斯地区采集的图兰扇头蜱R.turanicus中检测出马赛立克次体R.massiliae;从各地区采集的革蜱中均检测出饶氏立克次体R.raoultii,其在新疆范围内分布较广;从哈巴河地区采集的银盾革蜱Dermacentor niveus中检测出斯洛伐克立克次体R.slovaca;从乌鲁木齐地区采集的亚洲璃眼蜱Hy.asiaticum中检测出西伯利亚立克次体蒙古株R.sibirica mongolotimonae;从哈巴河地区采集的嗜群血蜱Hae.concinna中检测出黑龙江立克次体R.heilongjiangensis;从博乐地区采集的全沟硬蜱Ixodes persulcatus中检测出Candidatus R.tarasevichiae立克次体。结论新疆地区广泛分布多种蜱类,携带多种蜱传斑点热群立克次体,可能对人群健康产生潜在威胁。

新疆维吾尔自治区阿克苏地区牛羊体表蜱携带斑点热群立克次体调查

[目的]对新疆维吾尔自治区阿克苏地区牛羊体表蜱携带斑点热群(spotted fever group Rickettsia,SFGR)立克次体情况进行调查。[方法]从阿克苏地区阿克苏市(n=344)、温宿县(n=93)、沙雅县(n=98)、乌什县(n=39)随机采集牛羊体表蜱574只,以立克次体外膜蛋白B基因(ompB)和细胞表面抗原1基因(sca1)为靶基因,运用PCR方法检测立克次体携带情况,确定所属的SFGR基因型。选择2个基因的强阳性样本进行测序,将获得的序列与GenBank数据库中已登录的相关基因序列进行同源性比对,并构建系统发育树。比较4个县(市)蜱的立克次体感染率差异。[结果]对牛羊体表蜱携带的立克次体进行检测,发现存在3种SFGR基因型,分别为暂定巴布瑞立克次体(Candidatus Rickettisa barbariae)、西伯利亚立克次体(Rickettisa sibirica)、马赛立克次体(Rickettisa massiliae)。蜱样本中立克次体的总体阳性率为15.16%(87/574),温宿县的立克次体阳性率最高,为23.66%(22/93)。在检出的3种SFGR基因型中,暂定巴布瑞立克次体为优势种(Dr=44.83%,39/87)。4个县(市)蜱的立克次体感染率存在显著差异(P=0.001,χ2=15.834)。[结论]阿克苏地区是蜱及立克次体流行区,建议加强蜱及蜱传疾病的防控。

云南省大理市鼠、蜱中检测出斑点热群立克次体DNA

目的 了解鼠、蜱中自然感染斑点热群立克次体状况。方法 用PCR法检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热群立克次体DNA序列片段。结果 在云南省大理市下关野外山地捕获鼠类 9种 5 1只 ,从大足鼠 (1/ 15 )、大绒鼠 (1/ 7)和短尾 (1/ 8)各检出阳性 1份 ,其他鼠种均为阴性 ,总阳性率为 5 .88%。从采自弥渡县的 2 0 8只勐突血蜱中检出阳性 5份 ,阳性率为 2 .40 %。结论 初步认为云南省大理地区存在斑点热疫源地。

斑点热群立克次体新种──虎林－93株的分离和鉴定

本文用鸡胚卵黄囊培养法及实验动物感染法从黑龙江省虎林县境内采集的嗜群血蜱中分离到了一株立克次体。命名为ＨＬ－９３株立克次体。经形态学及血清学试验证实为斑点热群立克次体。分别用微量免疫荧光法、十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳法、单克隆抗体免疫酶斑点法、单克隆和多克隆抗体免疫印迹法、聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析法对该分离株进行鉴定并同已知国际标准株、国际及国内参考株进行比较。结果表明；ＨＬ－９３株立克次体无论在抗原性多肽上，还是在基因水平上在斑点热群立克次体中都是独特的。根据目前立克次体分类法，ＨＬ－９３株立克次体可以考虑是斑点热群立克次体的新种。

黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

目的调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%,与Rickettsia raoultii为99.18%。结论黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsiasp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。

我国斑点热立克次体新种检测及其rOmpA基因序列分析

采用斑点热群立克次体特异引物扩增福建南部来源蜱标本和动物标本中的DNA ,以发现我国可能存在的新种斑点热群立克次体。以立氏立克次体rOmpA基因序列中的相关序列为引物 ,扩增标本中rOmpA基因部分片段 ,用pGEM -T载体及其宿主菌进行阳性克隆筛选 ,阳性克隆经鉴定之后提取质粒DNA ,进行序列测定。测定序列用Blast软件进行序列同源性比较并采集相关序列 ,用Bootstrip方法随机取样 10 0次 ,用PHYLIP软件包进行聚类分析。共检测采自福建宁化地区的越原血蜱 10 0只和野鼠类血标本 38份。其中从越原血蜱(不同来源 )扩增出斑点热立克次体基因片段 ,阳性率为15 0 4% ( 17/ 113) ;并从社鼠、黄胸鼠、褐家鼠扩增出阳性片段 ,以鼠类为单位计算其阳性率为 44 73%。对寄生于野鼠的越原血蜱扩增的阳性片段序列分析表明新测序列与其它斑点热群立克次体的同一基因片段不同 ,其与日本立克次体同源性最高 ,核苷酸序列同源性为 94% ,推定的氨基酸序列同源性为89 %。从病原学角度首次证实我国福建省存在日本立克次体近缘种立克次体 。

广东省首次发现斑点热群立克次体的感染

本文采用微量间接免疫荧光方法首次在广东省大埔县、平远县和梅县１０１２名健康人中进行了斑点热群立克次体感染的血清流行病学调查。结果表明，三县西伯利亚立克次体的感染率平均为１６９９％，其中大埔县为２８４７％、平远县为２０４６％、梅县为６８％；康氏立克次体的感染率平均为２２６３％，其中大埔县为２７７８％、平远县为１３４２％、梅县为２５５９％；三县小蛛立克次体的感染率平均为１８２８％，其中大埔县为２１８８％、平远县为１８８０％、梅县为１５４９％。健康人群血清中斑点热群立克次体ＩｇＧ抗体阳性率经统计学处理未见有性别、年龄和职业的差别。上述结果提示在广东省大埔县。

部分省区啮齿动物中斑点热群立克次体的检测

目的了解我国部分省区啮齿动物中斑点热群立克次体的自然感染情况,比较南北地区不同鼠种带菌率的差异。方法在黑龙江、内蒙古、新疆、浙江和贵州5省(自治区)共捕获鼠473只,用聚合酶链反应检测鼠脾脏中的斑点热群立克次体DNA序列片段。结果共检测鼠473只,69只阳性,阳性率为14.6%;在黑龙江、内蒙古、新疆、浙江和贵州省(自治区)都检测出阳性标本,阳性率分别为3.1%、21.6%、30.0%、10.8%和21.4%。结论我国黑龙江、内蒙古、新疆、浙江和贵州省(自治区)的鼠中都存在斑点热群立克次体的感染,南北地区鼠的带菌率差异无统计学意义(P>0.05)。

黑龙江林区野鼠中斑点热群立克次体的核酸检测与序列分析

目的：了解黑龙江林区野鼠中斑点热群立克次体的感染情况。方法：运用聚合酶链反应方法对黑龙江地区采集的啮齿动物标本扩增斑点热群立克次体外膜蛋白A（OmpA）基因。阳性标本送测序并应用Mega5．0软件进行序列分析。结果：共检测鼠标本514份，斑点热群立克次体的阳性率为9．3％（95％CI：7．1％～12．2％），牡丹江、绥芬河、同江和东宁四个地区斑点热群立克次体的阳性率分别为12．4％（39／314），5．3％（3／57），2．0％（1／51），5．4％（5／92），地区间阳性率差异有统计学意义（P=O．023）。感染斑点热群立克次体的有仓鼠、大仓鼠、大林姬鼠、褐家鼠、黑线姬鼠、红背鼠平、鼠句黯、棕背鼠平、东方田鼠、明纹花松鼠10种，鼠种间阳性率差异有统计学意义（P=O．002）；棕背肝的阳性率最高，为22．1％（21／95）。测序结果显示鼠感染的斑点热群立克次体基因型是黑龙江立克次体基因型和一种新的未定种基因型。结论：黑龙江地区存在鼠感染黑龙江立克次体，同时可能存在未定种的新的斑点热群立克次体。

吉林省林区家畜中斑点热群立克次体与莱姆病螺旋体复合感染的血清学调查

目的了解吉林珲春地区家畜中斑点热、莱姆病及其复合感染的情况。方法应用间接免疫荧光法检测家畜血清中斑点热群立克次体和伯氏疏螺旋体的IgG抗体。结果牛血清中斑点热感染率为18.0%,莱姆病感染率为27.5%,复合感染率为9.5%;羊血清中斑点热感染率为19.2%,莱姆病感染率为31.5%,复合感染率为12.8%。结论吉林珲春地区家畜中广泛存在斑点热和莱姆病的复合感染。

四株斑点热群立克次体DNA同源性的初步研究

用缺口翻译法将斑点热群立克次体西伯利亚 246 株 DNA 和康氏 Simko株DNA标记^(32)P。分别与中国分离株黑龙江 054株和新疆精河株 DNA进行斑点杂交,以对国内两分离株基因组与北亚、康氏基因组同源性进行初步研究。结果显示,新疆精河株 DNA与西伯利亚246株DNA高度同源。与血清分类实验结果相吻合。黑龙江 054株DNA 与西伯利亚 246株 DNA和康氏 Simko 株 DNA的杂交阳性最低稀释度均低于阳性对照100倍以上。提示054株基因组与西伯利亚立克次体、康氏立克次体 Simko 株基因组存在较明显之差别。

黑龙江立克次体的免疫印迹分析

本文应用蛋白免疫印迹试验对黑龙江立克次体５４与３６株，国内分离株ＪＨ－７４、Ｈｕ－８４株及国际标准株西伯利亚２４６株，康氏Ｓｉｍｋｏ株，小蛛Ｋａｐｌａｎ株等斑点热群立克次体作抗原多肽分析。图谱表明，黑龙江立克次体５４与３６株两者完全一致，具有两条分子量为２１５ＫＤ、６６ＫＤ的主要抗原多肽带，和其它立克次体有明显区别，说明在抗原结构上的特异性。ＪＨ－７４、Ｈｕ－８４与西伯利亚２４６三者相同，同属一个种。斑点热群不同种间的抗原多肽带的数量与分子量互有差异。结果说明黑龙江立克次体可能为斑点热群一新种。

斑点热群立克次体中国分离株rOmpA基因片段的克隆和序列分析

用Rr190.70p-602n引物扩增了斑点热群立克次体（spottedfevergrouprickettsiae，SFGR）中国分离株（BJ－90株、Ha－91株和HLJ－054株）及SFGR国际标准株西伯利亚立克次体（Rickettsiasibiricu）246株和派克立克次体（R.parkeri）的rOmpA基因片段，将PCR产物克隆入pGEM－T载体中，用双脱氧法进行序列测定，并与SFGR的rOmpA基因已知序列进行了比较。结果表明，SFGR国际标准株间rOmpA基因片段的核苷酸同源性为90.06%～96.62%，推定氨基酸的同源性为83.05％～94.35％，中国分离株与国际标准株及参考株rOmpA基因片段比较的结果发现：BJ－90株及Ha－91株与西伯利亚立克次体标准株的核苷酸同源性分别为99．06％和98．31％，推定氨基酸的同源性则为98.87％和96.61％，HL－93株和HLJ-054株与日本立克次体（R.japonica）核苷酸同源性较高，分别为96.62％和95.68％，推定氨基酸的同源性为92．09％和89．27％。在中国分离株内，BJ-90株和Ha－91株的核昔酸同源性高达99．20％，推定氨基酸的同源性为97．74％，HIJ－054株和HL－93株rOmpA基因片段的核苷酸及推定氨基酸的同源性分别为98.12％，94.92％。因此认为在中国广阔的地域内，除HLJ-054株和HL-93株可能为SFGR的新成员外。

我国南方媒介蜱中首次检出黑龙江立克次体(R.heilongjiangii)及马赛立克次体(R.massilliae)近缘菌

目的研究我国南方媒介蜱斑点热群立克次体带菌状况。方法采用斑点热群立克次体外膜蛋白ompA基因特异引物,对我国广东省连平县采集的长角血蜱进行检测分析。结果15组蜱标本中,14组检测阳性,阳性率为93.3%。通过测序分析,发现当地长角血蜱携带黑龙江立克次体及马赛立克次体近缘菌。结论我国南方地区除已证实的北亚蜱传斑点热外,还应加强当地其他斑点热的监测及临床鉴别诊断。

斑点热群立克次体内蒙W-88蛛89102抗原的蛋白免疫印迹分析

蛋白免疫印迹试验表明从内蒙通辽病人旺某血标本分离的斑点热群立克次体W-88株与西伯利亚立克次体(232株及246株)的蛋白图谱完全相同,具有2个分子量为130KD及181KD的主要抗原性多肽及1个反应较弱的分子量为110KD的抗原性多肽,此与其它斑点热群立克次体不同。说明W-88株为西伯利亚立克次体。斑点热群立克次体中西伯利亚立克次体、立氏立克次体、康氏立克次体及派氏立克次体相互间抗原有较强的交叉反应。小蛛立克次体、澳大利亚立克次体与上述立克次体仅有微弱的交叉反应。说明斑点热群立克次体主要抗原分子有相同的决定簇。

应用单克隆抗体研究康氏立克次体的抗原特性

斑点热群立克次体的抗原成份极为复杂,它们拥有许多相同的抗原决定簇,也具有各自种特异性的抗原决定簇。本试验使用康氏立克次体(Rickettsia conorii)免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/O-Ag14融合,经克隆筛选,获得2株持续、稳定分泌抗康氏立克次体的单克隆抗体,经微量免疫荧光试验证实为种特异性。应用这2株单克隆抗体结合免疫印迹试验,对康氏立克次体的抗原成份进行初步分析,结果表明康氏立克次体脂多糖样(LPS-like)抗原具有种特异性的决定簇。

广东省首次分离斑点热群立克次体

目的 从宿主动物及蜱中分离斑点热群立克次体 ,以了解广东省是否存在斑点热自然疫源地。方法 从广东省封开县七星自然保护区采用笼日法捕活鼠 ,采集鼠脾及鼠表的蜱 ,用PCR进行初筛 ,鸡胚卵黄囊培养法直接分离立克次体 ,血清学试验对分离株进行鉴定。结果 采集鼠脾10 3份 ,鼠表的蜱 38匹 ;从 2只针毛鼠体表捉获的蜱中分离到 2株斑点热群立克次体 ,命名为GDFK5 8- 2 0 0 0株、GDFK5 9- 2 0 0 0株立克次体 ,经血清学鉴定为西伯利亚种。

气相色谱-质谱法对斑点热群立克次体——中国分离株的识别研究

本文报告应用气相色谱-质谱法分析了13株斑点热群立克次体(7株中国分离株和6株国际标准株)泛影葡胺密度梯度离心纯化物的全细胞脂肪酸成分。结果表明,各被检测的立克次体株所含主要脂肪酸成分百分含量有区别,所得色谱图经多元聚类法处理的7株中国分离株与国际标准株中的西伯利亚立克次体相近,而与其它国际标准株则有明显区别。