实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法的建立

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集的80份患者血标本进行检测并比较两者结果。结果成功建立了检测SFGR的实时荧光定量PCR方法,标准曲线的循环阈值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(r>0.99),且在检测SFGR核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性。结论该研究建立了基于TaqMan探针检测SFGR的实时荧光定量PCR检测方法,为临床实验室快速确诊SFGR疾病提供了快速、有效的技术手段。

黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

目的调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%,与Rickettsia raoultii为99.18%。结论黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsiasp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。

广东省首次分离斑点热群立克次体

目的 从宿主动物及蜱中分离斑点热群立克次体 ,以了解广东省是否存在斑点热自然疫源地。方法 从广东省封开县七星自然保护区采用笼日法捕活鼠 ,采集鼠脾及鼠表的蜱 ,用PCR进行初筛 ,鸡胚卵黄囊培养法直接分离立克次体 ,血清学试验对分离株进行鉴定。结果 采集鼠脾10 3份 ,鼠表的蜱 38匹 ;从 2只针毛鼠体表捉获的蜱中分离到 2株斑点热群立克次体 ,命名为GDFK5 8- 2 0 0 0株、GDFK5 9- 2 0 0 0株立克次体 ,经血清学鉴定为西伯利亚种。

一株斑点热立克次体的病原学研究

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明，系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性，分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n，扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证明，该分离株的DNA多态图谱与R．sibirica完全一致。上述结果可确证该分离株为西伯利亚斑点热立克次体种，称内85011株即NM-8501。

多聚酶链反应技术在斑点热群立克次体流行病学调查中的应用

作者首次用来自立氏立克次体（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ，Ｒｒ）１９０ＫＤａ蛋白抗原基因序列设计的一对引物扩增从黑龙江、河北、海南、北京采集的蜱、蜱卵、幼蜱、蜱粪及啮齿动物脏器中斑点热群立克次体ＤＮＡ。结果从上述标本中均检测出了斑点热群立克次特异的５３２ｂｐ大小的ＤＮＡ片段，该结果部分与同期进行的病原分离结果一致。故认为，ＰＣＲ技术是一种快速、敏感、特异的斑点热群立克次体流行病学调查方法。

中国黑龙江斑点热立克次体和日本斑点热立克次体基因型和血清型的比较

中国黑龙江斑点热立克次体和日本斑点热立克次体先后被鉴定为斑点热群中的两个新种。通过采用微量免疫荧光方法和聚合酶链扩增／限制性内切酶片段长度多态性分析技术，对两株斑点热立克次体进行了比较。结果显示，黑龙江立克次体抗血清与日本株抗原无交叉反应，黑龙江立克次体抗原与日本株抗血清仅呈低滴度反应。同时采用获自主氏立克次体蛋白抗原Ｒｒ１９０序列的一对寡核苷酸序列作为引物扩增上述两株立克次体后，用限制性内切酶ＲｓａＩ消化扩增产物，其Ｒｒ１９０－ＲｓａＩ图谱说明，两株的酶切带的迁移率明显不同。

辽宁省东部山区长角血蜱中SFGR DNA的检测和序列分析

目的调查辽宁省东部地区蜱类携带斑点热群立克次体(SFGR)情况及种型分布。方法采集辽宁省本溪、宽甸长角血蜱,提取DNA,采用PCR扩增SFGR ompA基因,并进行测序和聚类分析。结果 65份(368只)长角血蜱标本有7份扩增出SFGR OmpA基因片段,阳性率为10.77%。对其中3份标本的扩增片段(BH36、BH30、KD9)测序后进行聚类分析,ompA基因序列与SFGR河北株暂定种Candidatus R.hebeiii(HQ651815、HQ651817)同处于一个分支,同源性为99.83%~100%;与R.heilongjiangensis和R.japonica遗传距离较近,与其他SFGR遗传距离较远。结论辽宁省东部地区长角血蜱携带SFGR Candidatus R.hebeiii,且感染较普遍。