前导肽介导的SprD蛋白体外折叠研究

为提高以前体形式合成的蛋白质折叠与成熟效率,以枯草杆菌蛋白酶SprD为研究对象,通过蛋白重组表达、氨基酸定点突变、包涵体纯化结合体外复性、酶催化性能测定等方法比较各前体蛋白折叠成熟情况。结果表明,野生型前导肽介导的SprD前体蛋白可以在230 min内完成成熟,时间较长;成熟肽序列中E112A、S221A及S221C等突变导致相应前体蛋白成熟时间延长或成熟失败;而前导肽串联表达和切割位点酪氨酸缺失等措施可以将蛋白成熟时间缩短至80~160 min,成熟效率提高0.5~2.0倍,且成熟酶催化能力不受影响。前导肽序列中单个氨基酸位点改变对蛋白成熟影响较小,但对酶催化能力提升有一定帮助。因此,前导肽介导的蛋白成熟与酶催化能力的改变是2个相对独立的过程,前导肽表达方式与切割位点变化是促进蛋白体外成熟的较优方案。研究结果为加速蛋白成熟与蛋白改造提供了可参考方法。

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达（英文）

【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌(Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH 9-10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0-10.0)、中高温(25℃-60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。