抹茶菌群多样性分析

为了解抹茶菌群多样性,以不同企业不同等级的抹茶为试验材料,采用CTAB法提取样品总DNA,分别测定样品中微生物的16SrDNA基因V3、V4区序列。测序数据经质量控制、嵌合体过滤、高质量数据统计后,利用QIIME2软件获得扩增子序列变体ASVs特征表和特征序列,进行ASVs分布、α多样性、β多样性、物种和物种关系分析。结果表明,45个抹茶样本中有9个样本的菌群丰度极低,集中在高等级产品中。Z企业和Y企业的抹茶菌群ASVs数目、Chao1和Observed-species指数均与抹茶等级呈负相关性,而J企业抹茶的上述指标与抹茶等级不成相关性。Shannon指数表明影响各抹茶中菌群多样性的因素基本一致。抹茶组内样本间群落结构相近,企业内部样本间群落结构相近,同一企业不同批次但等级相同的样本菌群结构相近,产品微生态稳定性较好。36个抹茶样中共检测到物种29门、71纲、176目、345科、902属、1577种,其中变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为各组样本的绝对优势菌门,二者在ZA、ZB、ZC、YA、YB、JA、JB和JC中的丰度之和分别为96.34%、95.85%、96.06%、95.53%、95.31%、95.91%、96.06%和95.27%。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)和假单胞杆菌属(Pseudomonas)为各组的共有优势菌属(丰度≥2.00%),优势菌属在上述各组中的丰度之和分别为64.71%、65.61%、60.04%、70.65%、69.20%、72.98%、75.92%和76.57%。各组的共有优势菌属均属于变形菌门(Proteobacteria),ZB的第一优势菌属链球菌属(Streptococcus)属于厚壁菌门(Firmicutes)。本试验结果为阐明抹茶菌群多样性提供理论参考。

应用变性梯度凝胶电泳和16SrDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料,经过DNA抽提和PCR扩增,扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE,一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性.同时利用基因序列分析技术,分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列,并与现有的数据库进行了比较.结果表明,饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%);饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成,DGGE 谱带变化程度分别为 1 号 36% 、2 号 46% 、3 号 30%。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%,8个基因序列的相似性在90%～96%,余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中,只有1个被鉴定为Prevotella sp .,其余 4 个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。

耐热脂肪酶产生菌FS1403的分离筛选和16SrDNA基因序列的分析

从菲律宾火山口土样中分离、筛选获得一株产脂肪酶的耐热菌FS1403，对该菌脂肪酶的酶学性质初步研究表明：酶的最适作用温度为55℃，60℃处理1h保持70％酶活性，为中度耐热脂肪酶。酶的最适pH值为8．0，在pH7～pH10的条件下酶活都比较稳定。采用细菌16SrDNA通用引物，PCR扩增、克隆并分析了该菌的16SrDNA基因序列，同源性和系统发育学分析表明菌株FS1403与Bacillus subtilis具有最紧密亲缘关系。

抹茶加工过程中菌群多样性分析

为了解抹茶加工过程中的微生物多样性变化情况,以茶树鲜叶(X组)、碾茶(N组)和抹茶(F组)为研究对象,采用CTAB法提取样品微生物总DNA,测定样品中微生物的16SrDNA基因V3、V4区序列。测序数据经质量控制、嵌合体过滤、高质量数据统计后,用QIIME2软件获得扩增子序列变体ASVs特征表和特征序列,进行ASVs分布分析、α多样性分析、β多样性分析和物种分析。结果表明:X组、N组和F组中共检测出微生物ASVs分别为197个、1018个和1402个,特有ASVs分别为56个、435个和807个,共有ASVs为121个。α多样性分析显示,各组样品的Chao1、Observed-species、Shannon和Simpson指数存在显著性差异(P<0.05),稀释曲线均渐趋平缓,呈现F组高于N组高于X组的规律。β多样性分析显示:N组与F组的菌群结构相似,与X组的菌群结构不同。X组、N组和F组中分别含有5个、8个和10个菌门,共有优势菌门有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota),共有优势菌门累计在各组中占比分别为100.00%、99.93%和99.83%,各组间的变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)存在显著性差异(P<0.05);组分别含有23个、31个和31个菌属,共有优势菌属(相对丰度≥1%)为明串珠菌属(Leuconostoc)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)和乳球菌属(Lactococcus),共有优势菌属累计在各组中占比分别为86.58%、75.03%和67.80%。本研究可为抹茶产业的高质量安全发展提供一定的理论数据参考。

深海沉积物样品中古菌的16S rDNA分析

利用多管采样器,在太平洋西经177°42′20″,北纬10°35′06″的位置上,从水深5774m的海底获得深海沉积物样本,现场提取DNA进行保存,以此DNA为模板,利用古菌16S rDNA特异引物扩增出样品中古菌的16S rDNA,将扩增所得的16S rDNA进行克隆,建立了该样品中古菌的16S rDNA文库。对16S rDNA扩增片段进行了RFLP分析和序列分析,结果表明这些古菌在系统进化树上的位置靠近,属于Crenarchaeota中的Ⅰ类海洋古菌类群。

应用PCR-DGGE技术分析黄海冷水团海域的细菌群落组成

利用PCR-DGGE技术对2个季节（2006-04和2006-10）的黄海冷水团海域的细菌群落组成和优势菌群进行了分析.通过软件Glyko Bandscan分析DGGE图谱,4月份所有站位的条带数相近（约17条）,多样性丰富;10月份,在冷水团范围以内站位的条带约16条,其多样性也较丰富;而在冷水团范围以外站位的条带少（约12条）,其多样性较低.细菌16S rDNA V3区特征片段经DGGE分离、条带切割,共得到24条条带,克隆、测序后,进行系统进化分析,结果显示这24条带分别归属于2个细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroides）.在24条序列中有16条分别与变形细菌亚群的γ-和δ-Proteobacteria相似,有5条与拟杆菌门相似.时空分析发现,4月份所有站位水体（海水温度为7-12℃）的细菌群落组成和10月份（冷水团存在期）冷水团内部水体（海水温度低于10℃）的细菌群落组成相同（都包括γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Bacteroides）,与10月份冷水团外部水体（海水温度大于19℃）的（包括γ-Proteobacteria和Bacteroides）不同.优势菌群也存在同样的分布特点,4月份所有站位水体的优势菌群与10月份冷水团内部水体的优势菌群也相同（都是γ-Proteobacteria）,而10月份冷水团外部水体不同的站位优势菌群不同.该海域细菌群落组成和优势菌群的分布特点,可能与冷水团的形成有一定的相关性.

脂肪酸组分分析在不动杆菌鉴定中的应用

以不动杆菌属(Acinetobacter)中的A.baumannii、A.haemolyticus、A.johnsonii、A.junii、A.lwoffii模式菌株为参比菌株,对中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)所保藏的6株不动杆菌进行脂肪酸组分分析及16S rRNA基因系统进化分析。结果表明,利用脂肪酸分析可将6株菌完全准确地鉴定到属的水平上,这一点与16S rRNA基因分析结果一致;在种的水平上,16S rRNA基因进化分析与脂肪酸组分分析的结果可互为补充,相互印证。同时,通过对不动杆菌部分模式菌株及供试菌株的脂肪酸组分分析,报道了不动杆菌的特征性脂肪酸为C18:1 w9c、C16:00和C16:1w7c/C16:1w6c。

糖尿病患者右小腿脓肿分枝杆菌感染菌种鉴定分析

目的对糖尿病患者右小腿感染病原菌进行菌种鉴定分析。方法对病原菌进行温度生长试验(28℃、37℃及45℃)、革兰染色和抗酸染色,采用16SrDNA序列分析技术结合生化试验进行菌种鉴定。结果病原菌能在麦康凯琼脂28℃及37℃下生长,而45℃不生长。经16SrDNA序列分析技术鉴定为龟/脓肿分枝杆菌,同源度98.5%。生化试验结果为枸橼酸盐(28℃)阴性,28℃5%NaCl培养基生长试验阳性,病原菌鉴定为脓肿分枝杆菌。结论脓肿分枝杆菌是引起糖尿病患者右小腿感染的病原菌,16SrDNA序列分析技术结合生化实验可用于NTM的菌种鉴定。

利用16S rDNA序列分析宜宾芽菜中细菌菌群

使用ClustalX 2.0和MEGA 4.1软件对从宜宾芽菜中分离出的9株细菌(AY,AZ,AH,AI,AJ,AK,AL,AG,AO)的16SrDNA序列进行比对、分析,并绘制系统发育树。经鉴定,该9个菌株可分为3个种群,其中AY,AZ,AH,AL,AK,AJ这6个菌为第一种群;AO,AI为第二种群;AG为第三种群。结果表明:利用16SrDNA序列的分子生物学方法可以实现细菌菌群的快速分类鉴定,与传统方法相比具有简便、快速等优点。

甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析

采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析技术对采集自甘肃酒泉、嘉峪关等8个地区的豌豆、菜豆等几个不同豆科植物根瘤中分离的53株供试菌株和9株参比菌株进行了遗传和系统发育分析。16S rDNA PCR-RFLP结果表明,在77.5%的相似性水平上全部供试菌株聚成5个分支。分支I为Sinorhizhobium-Rhizobium分支,分支II为Agrorhizobium-Bradyrhizobium分支,分支III是未知供试菌组成的分支,分支IV为Mesorhizobium分支,分支V为2株未知供试菌组成的分支。在89.8%的相似性水平上,分支I包括2个亚分支:亚分支1由CNU1008等14株供试菌组成,与Sinorhizobium meliloti LISPA1002T菌株聚在一起;亚分支2包括6株未知菌,与Rhizobium leguminosarum USDA 2370T聚在一起。分支II包括3个亚分支:亚分支1包括CNU 1041等4株菌,与2株Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T和IAM 13569T聚在一起;亚分支2包括5株菌,与Bradyrhizobium japonicum USDA 6T菌株聚在一起;亚分支3包括3株未知菌。选取各分支和亚分支的代表菌株进行16S rDNA测序,结果表明,两种分析方法在结果上具有较好的一致性。处于分支I的Sinorhizobium亚分支的菌株,与S.fredii和S.meliloti的相似性达到99%,该亚分支菌株的确切系统发育地位有待于DNA-DNA杂交来确定。处于分支I的Rhizobium亚分支的菌株,与R.giardinii的相似性达到99%,与R.etli的相似性为98%。同样,该亚分支的确切地位有待于DNA-DNA杂交来确定。处于分支II Agrobaterium亚分支的菌株与A.rubi的相似性达到99%。处于分支II Bradyrhizobium亚分支的菌株,与B.liaoningense的相似性达到99%。

一株乳酸片球菌的筛选、鉴定及其固态发酵饲料原料的产酸分析

本研究从猪的新鲜粪便中分离纯化出一株具有较强产酸效果的乳酸菌HF14,综合形态、生理生化、16SrDNA序列分析,初步鉴定该菌株为乳酸菌片球菌(Pediococcus acidilactici)。对HF14固态发酵豆粕、麸皮、玉米粉与稻壳粉等饲料原料的产酸类别进行分析发现,产生的有机酸以L-乳酸与乙酸为主,其中,发酵玉米粉的pH最低,为3.77,L-乳酸与丙酸含量最高,分别为21.91、1.03mg/g;发酵麸皮的pH降幅最大,丁酸含量最高,为0.72mg/g;发酵稻壳粉的乙酸含量最高,为6.15mg/g,L-乳酸含量最低;发酵豆粕的各个指标居中。

剑尾鱼烂鳃、烂尾病病菌的分离鉴定

从有明显烂尾、烂鳃症状的剑尾鱼(Xiphophorus hellerii)体表病灶处、鳃及肝脏分离出优势菌株(1201F、1201H),分别采用肌肉注射和腹腔注射方式进行人工感染实验,证实菌株1201F和1201H均能够独立引起养殖剑尾鱼发病死亡,其对剑尾鱼的半数致死量分别为2.99×107cfu/尾、1.19×106cfu/尾。经形态学观察、生理生化特性分析以及16S rDNA基因测序确定菌株1201F为柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare),菌株1201H为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。其中菌株1201F与柱状黄杆菌(AB078047)的亲缘关系最近,置信度为90%;菌株1201H与维氏气单胞菌的亲缘关系最近,与维氏气单胞菌(JQ795750)聚为一个分支,置信度高达93%。对24种药物的敏感实验证实菌株1201F和菌株1201H同时敏感的抗生素有阿奇霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、左氟沙星、环丙沙星。

产甾体皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定

从华重楼(Paris polyphyllavar.chinensisFranch)的地下块茎中分离筛选得到2株可能产生甾体皂甙的内生菌(SS01和SS02),薄层层析检测菌株SS01、SS02的发酵产物分别有3条和2条层析带与重楼总皂甙的层析带迁移率相当。形态和生理生化特征初步表明SS01和SS02分属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)和芽孢杆菌属(Bacillussp.)细菌。扩增、测序得到SS01和SS02的部分16S rDNA序列,GenBank接收号分别为AY842143和AY842144。用Blastn调出与菌株16SrDNA同源的序列,用Clustal W进行多重序列对比,用软件Phylip按Neighbor-Joining方法构建16SrDNA系统发育树。菌株SS01和SS02分别与Cedecea davisae DSM4568、Paenibacillus daejeonensis处于同一分支,相似性分别为98.9%和97.7%,将它们鉴定为Cedecea davisae SS01和Paenibacillus daejeonensis SS02。

枣疯病植原体的快速检测

以表现丛枝症状的‘金丝4号’枣树为试材,以叶片总DNA粗提物为模板通过PCR扩增技术克隆16SrDNA基因,建立了枣疯病植原体快速检测方法。序列分析结果显示,枣疯病植原体‘金丝4号’株系(JWB-Jinsi4,TA)与JWB-G1(AB052876)同源性为99.7%,归属于16SrⅤ-B组。实验结果表明,以DNA粗提物为模板的PCR扩增技术,可快速有效地检测枣疯病植原体,为生产实践中枣疯病的诊断和防治提供技术支持。

部分茶饮料原辅料中优势菌-克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)的分离和鉴定

克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)是新兴的条件致病菌,主要通过污染的婴儿配方奶粉引起2岁以下婴幼儿严重疾病甚至死亡。在对茶饮料原辅料192份样品进行细菌总数测定和优势菌16S rDNA序列分析时,发现2批次绿茶和1批次果葡糖浆中优势菌疑似条件致病菌-克罗诺杆菌,而且其数量较高(4.0×102cfu/g^104cfu/g)。进而通过rpoB序列分析,将4个分离株鉴定为阪崎克罗诺杆菌Cronobacter sakazakii(原阪崎肠杆菌Enterobacter sakazakii)。结果表明在常见的食品原料-果葡糖浆和绿茶中存在克罗诺杆菌的污染,rpoB分型方法在对克罗诺杆菌属细菌的鉴定到种上表现出高度特异性,灵敏而准确。

鲐鱼中产组胺菌的分离筛选与生物学特性初步研究

利用产组胺菌鉴别培养基,对鲐鱼内脏中产组胺菌进行初步筛选,结合高效液相色谱分析方法对分离菌株的产组胺能力进行了确认;并通过菌株的生理生化、形态和16SrDNA基因序列分析对分离得到的菌株进行鉴定;研究了温度和pH对菌株生长和产组胺的影响。结果表明,从鲐鱼中初步分离的4株菌(T4、T5、T6和T9)在组胺发酵培养基中能够产生164.1～466.1μg/100mL组胺;经生理生化特性及16SrDNA序列测定为相同菌种,对其中T4菌株进行进化树分析,发现菌株T4与产粘液变形杆菌相似性最高。T4菌株生长和产组胺的最适温度均为20℃,最适pH均为7。

内蒙古传统乳制品中乳酸菌的分离鉴定及耐酸性能研究

目的筛选耐酸能力强、能耐受人体胃肠环境在肠道中存活的乳酸菌菌株。方法对采集自内蒙古地区牧民家庭中45份传统乳制品中的乳酸菌进行分离和和纯化,共分离出104株乳酸菌,并进行形态观察、碳水化合物代谢分析、16S r DNA序列分析、高通量耐酸性优良菌株的筛选和人工胃液耐受性分析等的研究。结果本研究共筛选到8株耐受人工胃液极佳的乳酸菌,经鉴定这些菌株为4株Lactobacillus plantarum(WHH727、WHH730、WHH777和WHH1118)、3株Lactobacillum fermentum(WHH734、WHH778和WHH868)和1株Lactobacillus acidophilus(WHH729)。其中,耐受人工胃液最佳的是L.fermentum WHH734,经p H为1.5的人工胃液处理2 h,存活率在86.32%,经p H为2.5的人工胃液处理2 h后,存活率为96.85%。结论菌株的分离鉴定以及高耐酸性菌株的筛选,对我国益生菌资源的保藏和开发有重要的意义。

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ES0 10 9中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3 ,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属 (Pseudoalteromonassp .)的Pseudoalteromonascitrea和Pseudoalteromonaselyakovii的同源性为 99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因celX全长 14 79bp ,编码一个 492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonashaloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有 95%的相似性 ,包括一个糖基水解酶家族 5的催化结构域 ,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现 ,CelX的最适温度为 40℃ ,酶的最适pH在 6～

厦门地区近海温泉嗜热菌的分离、鉴定

嗜热菌是一类特殊的极端环境微生物.本文所用的实验样品采集于厦门地区两个近海温泉的4个不同位点,通过16SrDNA序列分析对所分离到的312株细菌进行了归类总结,鉴定出嗜热栖热菌、嗜热脂肪泥土芽孢杆菌、嗜高温纤维分解菌、泥土芽孢杆菌属、水生栖热菌、假单胞菌属、木糖氧化无色杆菌、uncultured sheep mite bacte-rium、uncultured gamma proteobacterium等9种嗜热菌株,其中嗜高温纤维分解菌和嗜热栖热菌是主要的可培养优势菌群.其生长温度均在60-85℃,中性pH值.从而得出厦门地区近海温泉样品中的微生物生长类群信息,并发现了某些可能的新菌群,有助于了解该地区近海温泉特有环境下的可培养的微生物群落类型.

粒毛盘菌属及其相关属的分子系统学研究

晶杯菌科的分类目前主要基于子囊盘外囊盘被表面毛状物的形态学特征,在系统演化关系上十分不清楚。本研究利用18SrRNA基因核苷酸序列分析方法探讨该科粒毛盘菌属及其相关属间的系统发育关系。以Saccharomycescerevisiae为外群的严格合意树和最简约树表明,粒毛盘菌属与其相关的属形成三个分支。Lachnumhyalopus,L.nudipes和L.virgineum代表一个分支。L.brasiliense,L.sclerotii,L.singerianum,Albotrichaguangxiensis,Calycellinapopulina.,Cistellagrevillei,Hyaloscyphaaureliella,Lachnellulacalyciformis,Parachnopezizaguangxiensis和Trichopezizasulphurea聚在一起(支持率为57%),为另一个分支。上述两个姊妹分支的支持强度为76%。与Lachnum在形态上有些相似的Cistella和Lachnum聚在一起的支持强度为51%。传统上纳入Arachnopezizoideae的Parachnopeziza与该亚科的模式属Arachnopeziza的关系较远。Arachnopezizaaurata是供试的14个种中距离最远的一个,位于系统发育树的最外侧,与上述两个分支的亲缘关系较远,这对Arachnopezizoideae在晶杯菌科中的地位提出了质疑。