长喙田菁植物螯合肽合成酶基因在烟草中的表达

以pHANNIBAL及pART27为基础,构建了CaMV35S启动子驱动的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶SrPCS1基因植物超量表达载体pAM22,采用电击转化方法将pAM22导入根癌农杆菌EHA105,并用该菌株对烟草进行了转化,通过抗生素筛选、PCR及Northern-blotting检测了目的基因的表达水平,并用ClustalW对SrPCS1进行了进化分析。结果表明:SrPCS1编码233个氨基酸与豆科植物PCSs的同源性较高;得到27株抗性植株,23株PCR阳性植株,Northern-blotting证明得到了超量表达该基因的烟草14株,但基因的表达水平不同。

长喙田菁植物螯合肽合成酶PCS1的原核表达及纯化

为了获得纯化的长喙田菁(Sesbania rostrata)植物螯合肽合成酶PCS1,本研究以原核表达载体pMAL-c2x为基础,构建了含有SrPCS1开放阅读框序列的原核表达载体pAM56,并将其转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),对融合蛋白的表达进行了优化,通过Western blotting鉴定融合蛋白,且用麦芽糖亲和柱对MBP-SrPCS1融合蛋白进行了纯化。结果表明:在15℃下,经0.2 mmol/L IPTG诱导16 h表达出可溶性的MBP-SrPCS1融合蛋白,并通过亲和层析得到了纯化的MBP-SrPCS1融合蛋白,为进一步研究SrPCS1的活性及PCS的催化机制奠定了基础。