含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2变构抑制剂缓解放射性肺炎的作用效应与机制研究

目的探索含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)变构抑制剂对放射性肺炎的缓解作用及其可能的机制。方法以50 Gy的剂量进行双肺辐照建立辐射诱导放射性肺炎小鼠模型,分别提取SHP2变构位点抑制剂SHP099辐照组(辐照并予以SHP099灌胃)、辐照组(辐照未灌胃)、SHP099未辐照组(未辐照并予以SHP099灌胃)和对照组(未辐照且未灌胃)小鼠的肺组织制作HE切片。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测4组小鼠肺组织内炎性反应因子诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA水平。RT-qPCR检测小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)中iNOS、TNF-α和IL-6的表达情况。收集BMDM培养上清采用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的分泌情况。通过流式细胞术分析辐照后不同培养时间后RAW264.7和BMDM细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平。采用RT-qPCR检测10 Gy辐照后24 h RAW264.7细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)各亚基和同系物表达水平变化。采用蛋白质印迹法检测RAW264.7细胞中NOX4表达水平。结果通过SHP099灌胃辐射小鼠模型发现,SHP099预处理的辐照小鼠肺部损伤减弱,肺组织内炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达均下调(均P<0.05)。10 mmol/L SHP099预处理24 h后,RAW264.7和BMDM细胞因10 Gy辐照引起的上升的炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达均下降(均P<0.05)。收集BMDM细胞的培养上清显示,SHP099预处理也可减少辐照后TNF-α和IL-6蛋白的分泌(均P<0.05)。SHP099预处理也可降低10 Gy辐照后30 min引起的RAW264.7和BMDM细胞升高的ROS水平(均P<0.05)。采用RT-qPCR检测RAW264.7细胞10 Gy辐照后24 h NOX各个亚基和同系物的表达变化情况显示,p22^(phox)、p40^(phox)、Rac1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5表达均上调(均P<0.05),其中NOX4上调最多;而SHP099预处理可减少辐照后RAW264.7细胞的NOX4蛋白表达(P<0.01)。结论SHP2变构抑制剂可以缓解辐照诱导的小鼠肺部炎性反应。SHP2变构抑制剂可能是通过抑制巨噬细胞中NOX4的表达降低ROS产生,从而减少炎性反应因子分泌。

SRC同源区2结构域蛋白基因多态性与慢性乙型肝炎易感性的关系

目的探讨中国汉族人群细胞因子可诱导的SRC同源区2结构域蛋白(CISH)基因rs414171位点与慢性乙型肝炎易感性的关系。方法利用Sequenom MassArray-IPLEX SNP分型技术,对233例慢性乙型肝炎患者和148例健康对照者CISH基因的rs414171位点进行基因分型,采用χ2检验方法统计分析病例组与对照组间等位基因频率和基因型频率的差异。结果病例组和对照组的rs414171位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。该位点的等位基因频率和基因型频率在病例组和对照组中的分布无统计学差异(P>0.05)。结论 CISH基因rs414171位点的多态性与中国汉族人慢性乙型肝炎易感性无明显相关性。

Src同源2结构域转化蛋白和环氧化酶-2在大肠癌组织中的表达及意义

目的探讨Src同源2结构域转化蛋白(Shc)和环氧化酶(COX)-2在大肠癌的表达及意义。方法选择2010年1月至2013年10月在该院收治的资料完整的经病理学确认的大肠癌标本158例。采用免疫组化发检测大肠癌和癌旁组织的Shc和COX-2表达。结果 Shc表达在大肠癌组织中的细胞质和细胞核,COX-2表达在大肠癌组织中的细胞质。分化程度越低、浸润越深、远处转移和淋巴结转移的Shc和COX-2表达均有差异(P<0.05),不同性别、TNM分期Shc和COX-2表达无差异(P>0.05),Shc在年龄较高者表达较高(P>0.05),Shc和COX-2呈正相关(r=0.52,P<0.05)。结论 Shc与COX-2可能通过某种机制相互促进功能,共同参与大肠癌的发生发展。

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2抑制剂在肿瘤靶向和免疫治疗中的应用进展

由PTPN11基因编码的含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase, SHP2)是细胞关键调节因子蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)家族的一员,在多种恶性肿瘤中高表达。一方面,SHP2通过介导RAS-MAPK,PI3K-AKT和JAK-STAT等信号通路调节肿瘤细胞的生理功能。另一方面,在肿瘤微环境中,SHP2与免疫抑制受体[如程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等]结合,调节免疫细胞的功能,造成免疫微环境的抑制性。因此,SHP2在肿瘤中具有调节肿瘤细胞和免疫微环境的双重功能,提示其为极具价值的肿瘤治疗靶点。近年来,大量具有成药潜力的SHP2抑制剂进入临床试验,为肿瘤靶向治疗提供新的可能。目前SHP2抑制剂的研究已经取得一定成果,但仍存在较多耐药性、非特异性和毒性等问题。因此,需进一步研究SHP2抑制剂的成药性和靶向策略。本文对SHP2参与信号通路的调控机制和其在肿瘤和免疫微环境中的作用进行总结,并对SHP2抑制剂及其临床研究进展进行综述。

EHD2、miR-let-7c和lncRNA FOXD2-AS1在人喉鳞状细胞癌组织中的表达及其关联性分析

目的:探讨Eps15同源结构域蛋白2 (EHD2)、微小RNA let-7c (miR-let-7c)和长链非编码RNA (lncRNA)FOXD2-AS1在喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中的表达水平,阐明EHD2/miRlet-7c/FOXD2-AS1信号轴与LSCC发生的关联性。方法:收集40例LSCC患者的癌组织标本,按照病理类型分为低级别组(中或高分化,32例)和高级别组(低分化,8例),按照肿瘤淋巴结转移(TNM)临床分期分为TNM早期组(Ⅰ-Ⅱ期,13例)和TNM晚期组(Ⅲ-Ⅳ期,27例),按照有无淋巴结转移分为转移组(21例)和无转移组(19例)。另取40例对应癌旁正常组织标本作为对照组。采用免疫组织化学法检测各组标本中EHD2表达情况,分析其与LSCC患者临床病理参数之间的关系,采用生物信息学方法筛选出miR-let-7c作为候选微小RNA (miRNA),与其启动子区域存在结合位点的FOXD2-AS1作为候选lncRNA。取10对新鲜的LSCC组织标本和癌旁正常组织标本,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测2组样本中EHD2 mRNA、miRNA-let-7c和FOXD2-AS1表达水平,并验证其关联性。结果:与癌旁正常组织比较,LSCC组织中EHD2表达水平明显降低(P<0.01),且TNM早期组患者LSCC组织中EHD2阳性表达率明显高于TNM晚期组(P<0.05),病理类别和有无淋巴结转移与EHD2表达无明显关联(P>0.05)。与癌旁正常组织比较,LSCC组织中miR-let-7c表达水平明显降低(P<0.01),FOXD2-AS1表达水平明显升高(P<0.05)。LSCC组织中FOXD2-AS1与miR-let-7c表达水平呈负相关关系(r=-0.67,P<0.05),miR-let-7c与EHD2 mRNA表达水平呈负相关关系(r=-0.83,P<0.01)。结论:EHD2和miR-let-7c在LSCC组织中呈低表达,可能是新的抑癌基因;FOXD2-AS1在LSCC组织中高表达,可能是新的原癌基因;FOXD2-AS1/miR-let-7c/EHD2信号轴可能参与了LSCC的发生发展。

抑制SHP2和FGFR2调控RAS/ERK及PI3K/AKT通路治疗FGFR2融合胃癌

目的:探究共抑制成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)和Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)在FGFR2融合胃癌中的应用前景与作用机制。方法:构建过表达TACC2-FGFR2融合基因与对照慢病毒载体的人胃癌细胞系MKN45ACC2T-FGFR2、MKN45NC、NUGC4TACC2-FGFR2、NUGC4NC,分别用FGFR2抑制剂AZD4547、SHP2抑制剂SHP099或联药进行处理,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验检测肿瘤细胞的增殖、迁移能力。以不同处理方式作用于MKN45TACC2-FGFR2、MKN45NC1 h或48 h后,采用Western blot法检测FGFR2、SHP2以及下游RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路变化。结果:在MKN45TACC2-FGFR2与NUGC4TACC2-FGFR2中联用AZD4547与SHP099可以比单药更显著地抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。药物处理1 h后,相较于AZD4547单药,联药在MKN45TACC2-FGFR2中进一步抑制了RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路。药物处理48 h与1 h相比,AZD4547单药组中磷酸化FGFR与磷酸化SHP2出现了反馈性激活,且始终不能抑制RAS/ERK通路,但联药组可以持续地抑制上游的FGFR2、SHP2信号以及下游的RAS/ERK、PI3K/AKT通路。结论:共抑制FGFR2和SHP2可以通过下调RAS/ERK及PI3K/AKT通路有效抑制FGFR2融合胃癌,为FG-FR2融合突变胃癌患者带来新的治疗模式。

氧诱导视网膜病变模型小鼠视网膜组织中SHP2的表达及意义

目的探讨含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)及磷酸化SHP2(P-SHP2)在氧诱导视网膜病变(OIR)组织中的表达及意义。方法将20只清洁级C57BL/6J(B6)7日龄新生小鼠随机分为正常对照组和OIR组,每组10只。正常对照组小鼠与哺乳母鼠共同置于常氧、室温正常环境中饲养。OIR组小鼠与哺乳母鼠共同置于温度22~25℃、湿度(60±10)%、氧气体积分数稳定于(75±5)%的氧箱中,持续5 d后转移至常氧环境中。分别于12、14、17日龄时取正常对照组和OIR组小鼠各3只,采用Western blot法检测2组小鼠视网膜组织中SHP2、P-SHP2蛋白表达。随机取正常对照组和OIR组17日龄小鼠各2只,采用苏木精-伊红染色法观察小鼠视网膜组织病理学情况。结果正常对照组17日龄小鼠视网膜组织各层细胞结构排列整齐,内界膜与内皮细胞核均完整,形态正常。OIR组17日龄小鼠视网膜组织各层细胞间结构紊乱,可见血管内皮细胞核突破视网膜内界膜。不同日龄正常对照组小鼠视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=2.052,P>0.05)。正常对照组小鼠14、17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于12日龄时(P<0.05),17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于14日龄时(P<0.05)。OIR组小鼠14日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量显著高于12日龄和17日龄时(P<0.05);OIR组小鼠17日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量与12日龄时比较差异无统计学意义(P>0.05)。OIR组小鼠14日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著高于12日龄和17日龄时(P<0.05);OIR组小鼠17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量与12日龄时比较差异无统计学意义(P>0.05)。12、17日龄时,OIR组小鼠视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05);2组小鼠14日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。OIR组小鼠12日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05),17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05);14日龄时2组小鼠视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2及P-SHP2在OIR中均呈时间波动性的表达,缺氧可能促进了OIR小鼠SHP2构象的改变,以磷酸化形式发挥活性,并参与和促进了OIR的发生发展。

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2对AngⅡ刺激的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的:探讨含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing pro-tein tyrosine phosphatase 2,SHP-2)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)刺激的心肌成纤维细胞(cardiac fi-broblasts,CFs)增殖的作用。方法:差速贴壁法体外培养心肌成纤维细胞,以波形蛋白(vimentin)鉴定CFs纯度;MTT法检测AngⅡ作用下心肌成纤维细胞增殖率,采用重组腺病毒过表达SHP-2和SHP-2抑制剂NSC-87877分别对AngⅡ作用下的细胞增殖的影响。结果:AngⅡ对CFs增殖的促进作用有剂量依赖性,其促进细胞增殖的最高浓度为10-7mol/L;在AngⅡ的刺激下,SHP-2可以促进心肌成纤维细胞增殖,并且突变体组比野生型组增殖更明显(P<0.01)。SHP-2抑制剂NSC-87877达到50μmol/L时可以明显抑制AngⅡ刺激下的CFs增殖。结论:AngⅡ的促CFs增殖作用是通过SHP-2调控的。

SHP2及其变构抑制剂在肿瘤靶向治疗中的研究进展

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 region-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是由PTPN11编码的胞内非受体蛋白酪氨酸磷酸酶,已被证实参与多种癌症的发生发展,主要通过RAS/MAPK、PI3K/AKT、JAK/STAT、PD-L1/PD-1等信号通路调控肿瘤细胞生长、增殖、侵袭、凋亡和免疫逃逸。自2016年诺华团队发现了含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2的变构位点开始,对其抑制剂的研究已从催化位点抑制剂转向新型的变构位点抑制剂,克服了催化位点抑制剂高极性和特异性差的缺点,目前已有许多小分子化合物被报道,且具有成药潜力的含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2变构抑制剂相继被开发进入临床试验阶段。本文将重点介绍近5年文献报道的含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2靶点的结构与功能、在肿瘤靶向治疗中的价值及其变构抑制剂的研究进展。

基于SHP2的抗结直肠癌治疗策略

结直肠癌(CRC)作为威胁人类生命最常见的恶性肿瘤之一,其严重影响了患者的生活质量。含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SHP2)是一种由PTPN11基因编码的非受体酪氨酸磷酸酶,广泛表达于多种组织和细胞中。近年来,SHP2是癌症领域中备受关注的焦点,已经被证实为结直肠癌的促进因子。目前已有的研究表明,肿瘤微环境中,SHP2在调节免疫细胞功能和炎症性结直肠癌中发挥着重要作用;随着SHP2变构抑制剂的出现,SHP2成为了结直肠癌患者潜在的用药靶点,并且SHP2变构抑制剂的临床试验效果已经展现出了显著的抗结直肠癌治疗的优势。本文针对SHP2在结直肠癌中的角色,对SHP2在结构与功能、抗肿瘤微环境中的作用以及SHP2变构抑制剂在结直肠癌中的治疗策略进行综述。

胰腺导管腺癌组织中SHP2和URG4的表达及其临床意义

目的探讨SHP2和URG4在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学法检测82例胰腺导管腺癌组织中SHP2和URG4的表达情况。结果SHP2、URG4、SHP2及URG4双阳性表达在82例胰腺导管腺癌组织中,分别为46例(56.10%)、45例(54.88%)、43例(52.44%)。在胰腺导管腺癌中,SHP2与URG4表达之间存在显著的相关性(C=0.659,P<0.001)。在不同分化程度中SHP2蛋白表达差异有统计学意义(P=0.006)。在不同分化程度、淋巴结有无转移、TNM分期中URG4蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。在不同分化程度、淋巴结有无转移中SHP2/URG4双阳性表达差异均有统计学意义(P<0.05)。结论检测胰腺导管腺癌组织中SHP2和URG4表达情况对评估胰腺导管腺癌恶性程度、预测其侵袭转移趋势有重要意义,且有可能成为治疗靶点。

胰岛素对子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路活化的影响

背景与目的探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞Src同源区2结构域蛋白C（Shc）活化、Shc与生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的结合水平及对细胞外信号调节激酶（ERK）活化程度的影响。方法10-6mol/L胰岛素作用子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞不同时间,检测不同时间点细胞Shc磷酸化、Shc·Grb2复合物水平以及ERK的磷酸化程度。结果胰岛素以时间依赖方式活化导子宫内膜癌细胞Shc/ERK通路,Shc在胰岛素作用1min即出现活化增强,15min时达到峰值[p-p52Shc/p52Shc（73.75±2.93vs16.89±1.92）;p-p46Shc/p46Shc（35.65±5.17vs13.71±2.77）]。细胞静息状态下检测不到Shc·Grb2复合物,胰岛素能促进Shc·Grb2结合,与Shc活化时程一致,即1min可检测出Shc·Grb2结合,15min时结合程度最大。胰岛素显著诱导子宫内膜癌细胞ERK活化,具有时间依赖性,作用30min时达到峰值（p-ERK/ERK：63.40±4.52vs22.66±3.76）。结论胰岛素以时间依赖模式促进子宫内膜癌Ishikawa3-H^-12细胞Shc活化、Shc·Grb2结合以及ERK的活化。

SHCBP1在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的研究SHCBP1基因在人肝癌组织中的表达情况,探讨SHCBP1基因在肝细胞癌发生发展中的作用。方法采用半定量RT-PCR、荧光定量PCR(时实PCR)、免疫组织化学法等方法检测SHCBP1基因在52例临床肝细胞癌样本的癌及癌旁组织和人正常组织的表达情况,应用统计学方法分析结果。结果①SHCBP1基因mRNA表达水平在人正常组织中表达具有明显差异;在肝细胞癌样本中明显高于癌旁组织(P<0.05);②免疫组化结果检测显示SHCBP1蛋白在癌旁组织组织中低表达或不表达,而在肝细胞癌组织中表达明显增高,且棕色染色区域主要集中在肿瘤细胞边缘细胞膜位置;③Western blot检测结果显示SHCBP1蛋白在肝细胞癌样本中高表达,癌旁组织中不表达或低表达(P<0.05);④临床统计资料分析显示SHCBP1基因的表达情况与肝细胞癌患者的性别、年龄、临床分期无关,而与肿瘤的直径大小、个数、分化程度、脉管浸润紧密相关。结论 SHCBP1基因在肝细胞癌组织中呈高表达,可能通过影响多种癌症信号通路分子促进肝癌的发生发展,同时该基因可能成为肝癌治疗的潜在新靶点。

鸢尾苷元调控miR-103a-3p/SHC3通路对帕金森病模型细胞损伤的影响

目的探讨鸢尾苷元对帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型细胞损伤的影响,分析其是否与调控miR-103a-3p/含有Src同源结构域2的衔接蛋白3(SHC adaptor protein 3,SHC3)通路有关。方法用250 mmol/L的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^(+))诱导PC12建立PD细胞模型。PC12细胞分为对照组、PD组、PD+鸢尾苷元50μmol/L组、PD+鸢尾苷元100μmol/L组、PD+鸢尾苷元200μmol/L组、PD+anti-miR-NC组、PD+miR-103a-3p Inhibitor组、PD+鸢尾苷元+miR-103a-3p mimic组。CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞术分析各组细胞凋亡率,试剂盒检测各组细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平以及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量,RT-qPCR检测miR-103a-3p表达,Werstern blot检测SHC3蛋白水平。双荧光素酶报告实验分析miR-103a-3p和SHC3靶向关系。结果与对照组比较,PD组PC12细胞活力、SOD活性、SHC3蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、MDA水平、LDH释放量、miR-103a-3p表达显著升高(P<0.05)。与PD组比较,PD+鸢尾苷元50μmol/L组、PD+鸢尾苷元100μmol/L组、PD+鸢尾苷元200μmol/L组PC12细胞活力、SOD活性、SHC3蛋白表达显著升高(P<0.05),凋亡率、MDA水平、LDH释放量、miR-103a-3p表达显著降低(P<0.05)。与PD+anti-miR-NC组比较,PD+miR-103a-3p Inhibitor组PC12细胞活力、SOD活性、SHC3蛋白表达显著升高(P<0.05),凋亡率、MDA水平、LDH释放量显著降低(P<0.05)。与PD+鸢尾苷元组比较,PD+鸢尾苷元+miR-103a-3p mimic组PC12细胞活力、SOD活性、SHC3蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、MDA水平、LDH释放量显著升高(P<0.05)。miR-103a-3p与SHC3直接结合。结论鸢尾苷元可保护PD模型细胞凋亡和氧化损伤,其机制与抑制miR-103a-3p/SHC3通路有关。

新型SHP2衍生物NC-55-122在大鼠体内的药动学研究及其体内代谢产物分析

考察新型含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)蛋白抑制剂三唑并喹啉酮衍生物NC-55-122在大鼠体内的药代动力学特征,并在此基础上对化合物NC-55-122在大鼠体内的代谢产物进行分析。首先将大鼠随机分组,分别灌胃和静脉给予化合物NC-55-122,采集不同时间点的血样,以卡马西平为内标,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定大鼠体内NC-55-122的浓度,并进行方法学的验证,用DAS 2.0软件计算主要的药代动力学参数,采用Graph Pad Prism 8.0.1软件绘制血药浓度-时间曲线;并同时建立超高液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF/MS)对血浆样品进行分析,并运用UNIFI代谢产物预测软件分析经大鼠灌胃和静脉给药后的代谢产物。结果表明,化合物NC-55-122检测质量浓度的线性范围为1~1600 ng·m L^(-1),线性关系良好,在此线性范围内进行基质效应和提取回收率、精密度和准确度以及稳定性的考察,均符合生物分析要求;其次,药动学参数分析表明该化合物的口服生物利用度相对较低,仅为3.09%,但该化合物在体内吸收的速度较慢;最后通过分析离子流图以及结合UNIFI软件共推测出5个可能的代谢产物。本实验建立的检测方法灵敏度高,专属性强、快速、高效,适用于化合物NC-55-122在大鼠体内血药浓度的测定以及代谢产物的分析,为后期抗肿瘤药物NC-55-122的结构修饰以及成药性评价奠定基础。所有动物实验均经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号:2200823)。

胰岛素受体底物家族成员的结构和组织特异性与功能的关系

胰岛素(insulin)/胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)信号通路在细胞的分化、生长、生存及代谢起非常重要作用。胰岛素信号传递首先需要胰岛素/IGF-1与胰岛素受体(insulin receptor,IR)结合,磷酸化胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IR Ss)后形成一个紧密连接的三聚物。磷酸化的IRSs作为停靠蛋白(docking protein)再激活一系列包含Src同源结构域2(SH2)的蛋白,引起相应的生物学效应。目前发现IRSs从IRS-1到IRS-6共6种,它们的分布存在明显的组织特异性,IRS-1、2在人体多种组织中分布广泛;IRS-3则在脂肪组织中居多;而IRS-4、5、6在人体组织表达相对较低。本文拟对IRSs在组织中分布特异性与功能作一综述。

SHP2作为抗肿瘤治疗靶点的价值及其在肿瘤免疫治疗中的应用

包含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是目前唯一被证实具有促癌作用的细胞质蛋白酪氨酸磷酸酶,在多种恶性肿瘤中高表达。SHP2可以通过介导受体酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase, RTK)下游的RAS/ERK、PI3K/Akt和JAK/STAT等信号通路促进肿瘤发生发展,影响肿瘤预后。同时,SHP2参与调控PD-1/PD-L1、CTLA-4、BLTA和TIGIT等免疫检查点信号通路,对于肿瘤微环境中各种免疫细胞都有重要的调节作用。靶向SHP2不仅可以通过抑制RTK下游信号通路,还可以通过改善免疫微环境治疗恶性肿瘤。因此,SHP2具有免疫与靶向双重治疗肿瘤的功能,作为抗肿瘤治疗的靶点展现出极高的潜能与价值。

炎症环境下敲低SHP2对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨炎症环境下含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖及成骨分化的调节作用和相关机制,为牙周炎治疗提供新的靶点。方法使用慢病毒感染构建敲低SHP2基因的hPDLSCs细胞系,通过RT-qPCR、Western blot验证SHP2的敲低水平;使用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在体外模拟炎症环境;CCK-8检测正常及炎症条件下敲低SHP2对hPDLSCs增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、ALP活性检测、ARS染色、RT-qPCR以及Western blot检测成骨指标;Western blot检测敲低SHP2在炎症条件下,对丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB,MAPK/NF-κB)通路蛋白的影响。结果慢病毒感染细胞72 h后在荧光显微镜下显示出明显的绿色荧光,测得SHP2 shRNA重组慢病毒的滴度为2.9×10^(8) TU/mL;Western blot及RT-qPCR检测发现,SHP2敲低组的SHP2蛋白及基因的表达显著降低(P<0.001);在正常条件下,敲低SHP2在一定程度上抑制了hPDLSCs的增殖;敲低SHP2后,hPDLSCs的早期成骨指标增高,包括ALP活性显著增高,ALP和COL-1的表达增加(P<0.05),然而敲低SHP2对hPDLSCs最终产生钙结节的量无明显影响。在TNF-α和IL-1β诱导的炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响(P>0.05),敲低SHP2后,hPDLSCs成骨相关指标均增加(P<0.05),钙结节形成的量增多(P<0.05);炎症环境下,敲低SHP2后,hPDLSCs中p65的磷酸化和IκB-α的降解降低,并且NF-κB上游MAPK通路蛋白p-p38和p-JNK的表达降低(P<0.05)。结论炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响,但可通过抑制MAPK/NFκB通路促进hPDLSCs成骨分化。

SHP2调控巨噬细胞表型对系统性硬皮病纤维化病变的影响

目的探究含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)对系统性硬皮病(SSc)小鼠炎性反应及纤维化病变的影响,及其作用机制。方法将40只小鼠随机分为空白组、模型组和低、高剂量实验组,每组10只。除空白组外,其余3组小鼠均皮下注射博来霉素建立SSc模型。造模成功后,低、高剂量实验组分别腹腔注射2.5和5.0 mg·kg^(-1)PHPS1;空白组和模型组均腹腔注射等量的0.9%NaCl。4组小鼠每天给药1次,连续给药20 d。用免疫荧光染色法检测巨噬细胞浸润情况,用流式细胞术测定巨噬细胞极化情况,用实时荧光定量聚合酶链反应法检测M1型巨噬细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与M2型巨噬细胞重组人精氨酸酶1(Arg-1)、转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平。结果高剂量实验组和模型组、空白组的外周血F4/80+CD86+标记的M1型巨噬细胞比例分别为(16.81±1.59)%、(36.95±3.54)%和(1.70±0.15)%,F4/80+CD206+标记的M2型巨噬细胞比例分别为(18.49±1.76)%、(2.99±0.27)%和(16.62±1.49)%;上述3组皮肤组织中巨噬细胞标记物F4/80相对荧光强度分别为1.46±0.13、2.14±0.19和1.00±0.04,TNF-αmRNA分别为2.09±0.20、3.54±0.34和1.00±0.05,iNOS mRNA分别为1.63±0.15、3.28±0.31和1.00±0.04,Arg-1 mRNA分别为0.75±0.07、0.38±0.03和1.00±0.06,TGF-βmRNA分别为0.79±0.08、0.41±0.04和1.00±0.04;上述3组肺组织中TNF-αmRNA分别为1.46±0.14、2.61±0.25和1.00±0.04,iNOS mRNA分别为1.53±0.15、2.82±0.29和1.00±0.03,Arg-1 mRNA分别为0.67±0.07、0.31±0.03和1.00±0.05,TGF-βmRNA分别为0.71±0.07、0.39±0.04和1.00±0.05。高剂量实验组的上述指标与模型组相比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论SHP2抑制剂作用于SSc小鼠能够改善其皮肤组织和肺组织的炎性损伤及纤维化,该作用与调控巨噬细胞极化相关。

腺病毒介导的SD—HA对K562细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用机制

目的探讨融合蛋白SD—HA能否通过竞争结合BCR—ABL的第177位酪氨酸磷酸化位点（Y177p），调控与其相关的下游信号分子活性，进而抑制K562细胞增殖并诱导凋亡。方法Westernblot结合免疫共沉淀技术分析融合蛋白SD—HA与BCR．ABL的Y177p的相互作用，及其对下游信号途径Ras—MAPK和磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）．Akt的影响；Westernblot分析融合蛋白SD—HA对细胞膜受体死亡途径级联反应caspase-8、caspase-3和PRAP的影响。结果双向免疫共沉淀实验可检测到融合蛋白SD—HA能与Grb2竞争性结合BCR—ABLY177p，形成复合物。融合蛋白SD—HA可降低活化Ras、磷酸化MAPK（p—MAPK）、p-ELK的表达水平，抑制Ras—MAPK信号途径；融合蛋白SD—HA还可降低P—Akt及Akt的底物P—GSK的表达水平，抑制P13K—Akt信号途径，从而抑制K562细胞增殖；通过死亡效应结构域（DED）与caspases-8前体DED结合而寡聚化，激活caspases-8、caspase-3和PRAP，诱导K562细胞凋亡。结论融合蛋白SD—HA抑制BCR-ABL—Y177与Grb2结合的策略，可作为慢性髓性白血病治疗新的切入点。