SH2B1沉默对乳腺癌细胞增殖和凋亡及PI3K/Akt通路的影响

目的:探讨RNA干扰技术(RNAi)沉默Src同源性2B衔接蛋白1(SH2B1)对乳腺癌细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法:体外培养人正常乳腺上皮细胞MCF-10a与乳腺癌细胞MCF-7,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞中SH2B1mRNA及蛋白表达水平。采用RNAi技术将SH2B1阴性对照质粒、si-SH2B1分别转染至MCF-7细胞,分别命名为si-NC组、si-SH2B1组,未经处理的MCF-7细胞命名为空白对照组。采用RT-PCR法检测各组MCF-7细胞中SH2B1、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白X(Bax)、天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)mRNA表达水平;CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期情况;Westernblot法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、PI3K及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、Akt及其磷酸化蛋白(p-Akt)等蛋白表达情况。结果:与MCF-10a细胞相比,MCF-7细胞中SH2B1mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05);与空白对照组、si-NC组相比,si-SH2B1组SH2B1mRNA及蛋白表达、S期与G2/M期DNA量、Bcl-2mRNA及蛋白表达均显著降低(P<0.05);MCF-7细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、G0/G1期DNA量、Bax、Caspase-3mRNA及蛋白表达均显著升高(P<0.05);WB法显示,si-SH2B1组MCF-7细胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著低于空白对照组、si-NC组(P<0.05)。结论:SH2B1沉默可抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡,其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。

SH2B1对肝癌细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR通路的影响

目的观察Src同源性2b衔接蛋白1(SH2B1)在肝癌细胞中表达情况,以及对肝癌细胞增殖、凋亡及蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/m TOR)信号通路的影响。方法通过荧光实时定量聚合酶链反应法检测人正常肝细胞株QSG-7701及肝癌细胞株Hep G2中SH2B1 mRNA的表达情况,采用免疫印迹法(Western blot法)检测SH2B1蛋白表达,采用短发夹RNA(shRNA)慢病毒干扰技术构建沉默SH2B1基因的人肝癌细胞Hep G2稳定转染细胞株,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测Hep G2细胞增殖能力,采用磷脂酰丝氨酸蛋白抗体/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测Hep G2细胞凋亡,采用Western blot法测定凋亡细胞相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3以及Akt/m TOR通路蛋白表达变化。结果与正常细胞相比,肝癌细胞中SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白相对表达量显著升高(P <0. 05);与空白组、NC shRNA组相比,SH2B1 shRNA组SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白表达显著降低(P <0. 05);CCK-8试验显示,与NC shRNA组和空白组相比,SH2B1 shRNA组转染48 h后OD值显著降低(P <0. 05);与空白组、NC shRNA组相比,SH2B1 shRNA组细胞凋亡率显著升高(P <0. 05);与空白组、NC shRNA组相比,SH2B1 shRNA组细胞中Bax、caspase-3蛋白水平显著上升(P <0. 05),Bcl-2蛋白水平下降(P <0. 05);与空白组和NC shRNA组相比,SH2B1 shRNA组p-AKT、m TOR蛋白水平明显降低(P <0. 05)。结论 SH2B1在肝癌细胞株Hep G2中高表达,沉默SH2B1表达可能通过抑制Akt/m TOR信号通路活化,抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

SH2B1对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响和机制研究

目的研究同源性2b衔接蛋白1(SH2B1)对心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响及具体机制。方法将分离培养好的乳鼠心肌细胞随机分为对照组、AngⅡ组。采用荧光定量PCR检测心肌肥大标志物ANP、BNP的mRNA表达变化,Western Blot检测SH2B1、糖代谢相关蛋白GLUT4、G6PD和信号通路AMPK的表达水平。为了进一步探索SH2B1在心肌肥厚中发挥的作用,采用小干扰RNA(siRNA)沉默SH2B1基因,将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、siSH2B1组、siSH2B1+AngⅡ组;48 h后检测上述指标的变化。然后使用AMPK抑制剂compound C处理乳鼠心肌细胞,检测AMPK对糖代谢相关蛋白的影响,将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+compound C组,Western Blot检测GLUT4、G6PD的蛋白表达水平。结果与对照组相比,AngⅡ组SH2B1、GLUT4、G6PD蛋白表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05),AMPK表达差异无统计学意义(P>0.05),而磷酸化AMPK表达增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。与siNeg组相比,siSH2B1组SH2B1表达量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与siNeg+AngⅡ组相比,siSH2BI+AngⅡ组GLUT4、G6PD蛋白表达减少,AMPK的磷酸化水平减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论SH2B1可通过促进心肌细胞糖代谢而加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其机制可能与AMPK信号通路相关。

SH2B1基因多态性与2型糖尿病发病相关性的研究进展

遗传易感性在2型糖尿病(T2DM)的发生发展过程中具有重要作用。类固醇受体共激活因子同源性2B衔接蛋白1(SH2B1)是一种重要的调节人体代谢的衔接蛋白,通过参与瘦素、胰岛素等多种激素的信号转导途径,影响T2DM的发病及病程进展。研究显示,SH2B1基因多态性与T2DM显著相关,SH2B1通过增加胰岛素信号及调控β细胞参与胰岛素信号转导,通过增加瘦素信号来参与瘦素信号转导,通过增加成脂转录调节因子的表达来参与脂肪细胞分化。研究SH2B1基因多态性与T2DM发病的相关性,可为糖尿病的预防及治疗提供新的思路。

山茱萸环烯醚萜苷对蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化的调节机制

目的探讨山茱萸环烯醚萜苷(Cornel iridoid glycoside,CIG)上调蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A),PP2A活性抑制tau蛋白磷酸化的作用机制。方法 1确定最佳转染条件:将Src质粒DNA(0.2、0.4、0.6、0.8μg)瞬时转染入小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2A cell,N2a细胞),观察不同量Src对PP2A催化亚基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影响;2将0.6μg Src质粒DNA转染入N2a细胞,24 h后加入CIG(50、100、200μg/m L)共同孵育24 h,观察CIG对Src、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)、p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。结果 1转染Src(0.2、0.4、0.6μg)质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达明显增加,p-PP2Ac水平上调,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位点磷酸化显著增加;转染0.8μg Src质粒DNA到N2a细胞与转染0.6μg Src相比,p-PP2Ac表达下降,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位点磷酸化降低。2转染0.6μg Src质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达增加,p-PP2Ac表达增加,tau蛋白在Ser199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化明显增加;CIG对Src蛋白表达无影响,能够抑制p-PP2Ac的表达,抑制tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化。此外,CIG能上调PTP1B蛋白表达。结论 CIG对Src蛋白无明显调节作用,但能通过增加PTP1B的表达,降低PP2A催化亚基C磷酸化,从而升高PP2A活性,进一步降低tau的过度磷酸化。CIG对tau蛋白过度磷酸化的抑制作用,将会给阿尔茨海默病的治疗带来广阔的应用前景。

SIRT1对H2O2诱导的人卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的影响

目的·探讨沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在H2O2诱导的人卵巢颗粒细胞氧化应激损伤中的作用及可能机制。方法·分别用0、100、250、500、1000μmol/L H2O2处理人卵巢颗粒细胞SVOG 4、8、12、24 h,CCK-8法检测细胞活力,选择合适的H2O2浓度和处理时间用于建立颗粒细胞体外氧化应激损伤模型。荧光显微镜观察H2O2处理后细胞核形态变化,试剂盒检测细胞丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;实时定量PCR、Western blotting分析分别检测SIRT1、衔接蛋白P66SHC(the 66 kDa Src homology 2 domain containing isoform)及B淋巴细胞瘤-2因子(B-cell lymphoma-2,BCL-2)mRNA和蛋白的表达水平;脂质体转染SIRT1过表达质粒后,SVOG细胞再经H2O2处理,同样观察上述指标的变化。结果·250μmol/L H2O2处理SVOG细胞12 h,可诱发细胞活力明显下降(P=0.017),细胞核固缩,MDA含量增加(P=0.001),SOD活性下降(P=0.006);伴随SIRT1、BCL-2 mRNA和蛋白表达降低,P66SHC表达升高。SIRT1过表达后再经H2O2处理,与H2O2处理组相比,SVOG细胞核恢复正常形态,MDA含量下调(P=0.038),SOD活性回升(P=0.021),P66SHC表达降低(P=0.002),BCL-2表达升高(P=0.013)。结论·SIRT1可能通过下调P66SHC和上调BCL-2的表达发挥对抗人卵巢颗粒细胞氧化应激损伤的作用。

炎症环境下敲低SHP2对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨炎症环境下含有Src同源结构域2的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP2)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)增殖及成骨分化的调节作用和相关机制,为牙周炎治疗提供新的靶点。方法使用慢病毒感染构建敲低SHP2基因的hPDLSCs细胞系,通过RT-qPCR、Western blot验证SHP2的敲低水平;使用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)在体外模拟炎症环境;CCK-8检测正常及炎症条件下敲低SHP2对hPDLSCs增殖的影响;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、ALP活性检测、ARS染色、RT-qPCR以及Western blot检测成骨指标;Western blot检测敲低SHP2在炎症条件下,对丝裂原活化蛋白激酶/核因子κB(mitogen-activated protein kinase/nuclear factor-κB,MAPK/NF-κB)通路蛋白的影响。结果慢病毒感染细胞72 h后在荧光显微镜下显示出明显的绿色荧光,测得SHP2 shRNA重组慢病毒的滴度为2.9×10^(8) TU/mL;Western blot及RT-qPCR检测发现,SHP2敲低组的SHP2蛋白及基因的表达显著降低(P<0.001);在正常条件下,敲低SHP2在一定程度上抑制了hPDLSCs的增殖;敲低SHP2后,hPDLSCs的早期成骨指标增高,包括ALP活性显著增高,ALP和COL-1的表达增加(P<0.05),然而敲低SHP2对hPDLSCs最终产生钙结节的量无明显影响。在TNF-α和IL-1β诱导的炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响(P>0.05),敲低SHP2后,hPDLSCs成骨相关指标均增加(P<0.05),钙结节形成的量增多(P<0.05);炎症环境下,敲低SHP2后,hPDLSCs中p65的磷酸化和IκB-α的降解降低,并且NF-κB上游MAPK通路蛋白p-p38和p-JNK的表达降低(P<0.05)。结论炎症环境下,敲低SHP2对hPDLSCs的增殖无明显影响,但可通过抑制MAPK/NFκB通路促进hPDLSCs成骨分化。

SH2B1在非小细胞肺癌中的表达水平及与临床病理参数和预后的关系

目的观察SH2B衔接因子蛋白1(SH2B1)在非小细胞肺癌组织中表达情况,并探讨SH2B1与临床病理特征及预后的关系。方法选取2013年9月-2015年6月在青海省第五人民医院进行手术治疗的51例非小细胞肺癌患者的癌组织标本为非小细胞肺癌组织组,另选取距癌组织边缘≥5 cm的癌旁组织作为癌旁组织组。分别采用荧光实时定量聚合酶链反应法(qRT-PCR)与免疫印迹法(Western blot)检测SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白相对表达情况;应用免疫组织化学法(SP)检测SH2B1蛋白表达;分析SH2B1与临床病理参数的关系,采用Kaplan-Meier对非小细胞肺癌患者3年生存情况进行分析;并对影响非小细胞肺癌预后的因素进行COX回归分析。结果与癌旁组织相比,非小细胞肺癌组织中SH2B1 mRNA、SH2B1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),SH2B1蛋白阳性率显著高于癌旁组织(62.7%vs.31.4%)(P<0.05)。SH2B1在有淋巴结转移、分化程度低、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期患者癌组织中表达量高于无淋巴结转移、分化程度中高、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示SH2B1高表达组三年内存活率低于SH2B1低表达组(18.8%vs.63.2%)(P<0.05);多因素COX回归分析结果显示SH2B1阳性表达是影响非小细胞癌不良预后的独立危险因素。结论SH2B1基因在非小细胞肺癌组织中高表达,其异常表达与患者临床病理指标及预后不良密切相关,推测SH2B1可能参与非小细胞肺癌的癌变过程。