CD45分子对Src家族蛋白酪氨酸激酶活性的调节

CD4 5分子发挥磷酸酶活性使Src家族蛋白酪氨酸激酶的抑制位点磷酸化 ,激酶区内自磷酸化位点去磷酸化 ,而Src家族蛋白酪氨酸激酶的这两个主要的磷酸化位点的磷酸化状态决定了激酶的活性。因此 ,CD4 5分子既可对Src家族蛋白酪氨酸进行正向调节。又可对其进行负向调节 ;在TCR相关信号传递过程中 ,CD4 5分子对Src家族激酶起正向调节作用 ;在整合素介导粘附过程中 ,CD4 5分子对Src家族激酶起负向调节作用。这是因为细胞内的微环境不同 ,CD4 5分子对于Src家族激酶活性的调节功能也就不同 。

Src家族蛋白酪氨酸激酶(SFKs)对血管内皮细胞通透性的调节作用

血管内皮细胞是机体重要的屏障和半透膜.溶质渗出主要经细胞旁途径和穿细胞途径,分别与细胞屏障结构受损和质膜小凹(caveolae)或囊泡的形成与分离有关.Src家族蛋白酪氨酸激酶(SFKs)可使一些屏障结构蛋白(如VE-cadherin、连环蛋白、踝蛋白、纽蛋白)和质膜小凹形成与分离相关的蛋白(如小凹蛋白-1、发动蛋白-2)磷酸化,破坏屏障结构和增加质膜小凹的形成与分离.因此,SFKs对血管内皮细胞通透性具有重要的调节作用.本文就SFKs如何调节血管内皮细胞通透性做一详细介绍.

胎盘生长因子、可溶性fms样酪氨酸激酶-1及糖基化纤连蛋白在子痫前期预测中的应用价值

目的:探讨胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1,SFLT-1)和糖基化纤连蛋白(glycosylated fibronectin,GLYFN)检测对子痫前期的预测价值。方法:选择在无锡市妇幼保健院就诊的188例孕妇,分154例正常孕妇(对照组)和34例子痫前期患者(子痫组),应用免疫荧光法分别检测其在孕16~18周血清中PLGF、SFLT-1和GLYFN的浓度,比较子痫前期组和对照组各标志物的水平,并使用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)对3种标志物的预测价值进行效能评估。结果:在妊娠中期,子痫前期组血清PLGF浓度低于对照组,SFLT-1及GLYFN浓度均高于对照组,3种标志物的差异均有统计学意义(3指标P=0.000)。95%置信区间的ROC曲线下面积(areas under the ROC curve,AUC)为,PLGF为0.941(0.907~0.974),SFLT-1为0.881(0.800~0.962),GLYFN为0.951(0.918~0.985),联合指标SFLT-1和GLYFN、3项指标联合检测在ROC曲线下面积(areas under the ROC curve,AUC)分别为0.968、0.986。结论:PLGF、SFLT-1、GLYFN 3种标志物水平在对照组和子痫前期组均存在明显差异,对子痫前期的发病具有一定的预测价值,SFLT-1联合PLGF、SFLT-1联合GLYFN、3项指标联合检测对子痫前期的预测价值高于任一单项指标。

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2变构抑制剂缓解放射性肺炎的作用效应与机制研究

目的探索含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)变构抑制剂对放射性肺炎的缓解作用及其可能的机制。方法以50 Gy的剂量进行双肺辐照建立辐射诱导放射性肺炎小鼠模型,分别提取SHP2变构位点抑制剂SHP099辐照组(辐照并予以SHP099灌胃)、辐照组(辐照未灌胃)、SHP099未辐照组(未辐照并予以SHP099灌胃)和对照组(未辐照且未灌胃)小鼠的肺组织制作HE切片。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测4组小鼠肺组织内炎性反应因子诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA水平。RT-qPCR检测小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)中iNOS、TNF-α和IL-6的表达情况。收集BMDM培养上清采用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的分泌情况。通过流式细胞术分析辐照后不同培养时间后RAW264.7和BMDM细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平。采用RT-qPCR检测10 Gy辐照后24 h RAW264.7细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)各亚基和同系物表达水平变化。采用蛋白质印迹法检测RAW264.7细胞中NOX4表达水平。结果通过SHP099灌胃辐射小鼠模型发现,SHP099预处理的辐照小鼠肺部损伤减弱,肺组织内炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达均下调(均P<0.05)。10 mmol/L SHP099预处理24 h后,RAW264.7和BMDM细胞因10 Gy辐照引起的上升的炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达均下降(均P<0.05)。收集BMDM细胞的培养上清显示,SHP099预处理也可减少辐照后TNF-α和IL-6蛋白的分泌(均P<0.05)。SHP099预处理也可降低10 Gy辐照后30 min引起的RAW264.7和BMDM细胞升高的ROS水平(均P<0.05)。采用RT-qPCR检测RAW264.7细胞10 Gy辐照后24 h NOX各个亚基和同系物的表达变化情况显示,p22^(phox)、p40^(phox)、Rac1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5表达均上调(均P<0.05),其中NOX4上调最多;而SHP099预处理可减少辐照后RAW264.7细胞的NOX4蛋白表达(P<0.01)。结论SHP2变构抑制剂可以缓解辐照诱导的小鼠肺部炎性反应。SHP2变构抑制剂可能是通过抑制巨噬细胞中NOX4的表达降低ROS产生,从而减少炎性反应因子分泌。

新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC)的设计合成及活性评价

目的 设计合成新型布鲁顿氏酪氨酸激酶蛋白水解靶向嵌合体(BTK PROTAC),并在体外评估这些分子对BTK蛋白的降解活性。方法 以Nurix Therapeutics公司临床化合物NX-5948为先导化合物,分析其与靶蛋白的相互作用,通过引入并环代替吡嗪胺的骨架跃迁思路对其进行结构改造,成功合成了一系列新型BTK PROTACs,通过时间分辨荧光共振能量转移技术(TR-FRET)、MTS法和蛋白质免疫印迹法分别测定目标化合物的激酶活性、细胞增殖抑制活性和BTK蛋白降解活性。结果 共合成6个目标化合物(化合物B~G),活性测试结果显示,大部分化合物都具有优异的细胞增殖抑制活性和BTK降解活性,其中化合物B表现出较优的BTK蛋白降解能力,其半数最大降解浓度(DC_(50))值约为0.1 nmol·L^(-1)。结论 基于NX-5948,通过骨架跃迁的方法设计合成了一类新颖的BTK PROTAC化合物,进行了构效关系的初步探索,可为BTK PROTAC降解剂的进一步研究提供参考。

Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子诱导的肺腺癌细胞生长的作用及机制

目的 探讨Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子(EGF)诱导的肺腺癌细胞生长浸润的作用及其机制。方法 选用PC-9和A549细胞进行培养,分别给予不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂和EGF,利用MTT比色法和Boyden-chamber法检测PC-9和A549细胞增殖及浸润情况,台盼蓝染色检测细胞活力,蛋白质印迹检验Src蛋白的表达和磷酸化及其下游信号磷酸化情况。结果 抑制Src酪氨酸激酶可以在不影响细胞活力的情况下抑制PC-9和A549细胞的增殖浸润,EGF可以增强EGF受体(EGFR)、Src、促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及AKT的磷酸化,Src酪氨酸激酶抑制剂可以抑制这种磷酸化。结论 抑制Src酪氨酸激酶可以通过调节EGFR及其下游信号通路抑制肺腺癌细胞的增殖浸润。

酪氨酸激酶抑制剂调控宿主抗结核作用的研究进展

尽管现有的抗结核治疗方案在药物敏感结核病患者的治疗中取得了显著成效,但是药物毒性及耐药菌株的问题日益突出。因此,研究者们开始寻找新的药物和治疗策略,以期更好地治疗结核病。宿主导向治疗(host-directed therapy,HDT)可利用小分子化合物调节宿主的免疫反应,进而保护组织并清除病原体。HDT的主要目的是增强宿主的抗结核免疫功能,同时缩短传统抗生素治疗的时间,提高治疗效果,被视为治疗结核病的一种有前景的方法。酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)主要参与激活细胞信号转导,从而调节细胞生长、增殖、死亡等一系列生理生化过程。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)是一种新型抗癌药物,在多种恶性肿瘤中可靶向过表达细胞通路,也可通过诱导自噬并激活其他信号通路发挥抗肿瘤活性。研究发现,TKI也可以在巨噬细胞中调节信号转导过程,降低胞内结核分枝杆菌的载量,具有巨大的治疗潜力。因此,TKI可作为HDT的潜在候选药物,应用于临床辅助治疗结核病。笔者将从PTK及信号转导入手,针对潜在的HDT治疗结核病的靶向药物研究进行综述,旨在为HDT疗法更好地应用于现有药物及研发新药,从而辅助治疗结核病提供参考。

Src-家族酪氨酸激酶对皮质性白内障晶状体中缝隙连接蛋白的影响

目的探讨抑制Src-家族酪氨酸激酶的异常激活在皮质性白内障的形成中对晶状体缝隙连接蛋白43(Cx43)的影响。方法分离10d的鸡胚胎全晶状体并在M199培养液中培养10d为对照组;加入0.1nmol/LSFK特异性抑制剂PP1作为PP1组。观察2组晶状体的混浊程度、计算晶状体的混浊面积百分比。对培养1、5、10d的晶状体细胞进行WGA、DAPI免疫荧光染色,观察晶状体组织学改变及Cx43分布和表达量的变化。在晶状体前囊膜上进行Lucifer Yellow染料负荷试验,测量染料弥散距离,评价缝隙连接的功能。结果对照组晶状体的混浊面积百分比在4d、10d分别为26%和50%,而PP1组为20%和14%(P<0.01)。培养5d、10d对照组晶状体上皮细胞(LECs)出现死亡,Cx43主要在LECs间表达;PP1组LECs死亡明显减少,Cx43的表达在上皮与纤维的交界面明显增强。在培养后1d、10d,对照组染料弥散距离与PP1组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论在体外培养鸡胚晶状体模型中,PP1可能通过保护Cx43缝隙连接功能以保持晶状体上皮组织结构正常,减缓皮质性白内障的发生。

自噬相关基因在Janus蛋白酪氨酸激酶抑制剂治疗类风湿关节炎前后患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义

目的:探讨自噬相关基因(ATGs)是否参与类风湿关节炎(RA)的发生发展及Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)抑制剂治疗前后的自噬表达变化。方法:收集30例经JAK抑制剂治疗24周的RA患者(RA组)的临床、实验室资料及外周血标本;同时收集30名健康者(HC组)外周血标本作为对照。实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中自噬相关基因的表达水平。结果:RA组ATG5、Beclin-1、LC-3的mRNA表达水平均高于HC组;ATG16的mRNA表达水平低于HC组(P<0.05)。RA组ATG5表达水平与ESR、hsCRP、SJC、PtGA、DAS-28(ESR)、CCP正相关(P<0.05);ATG12表达水平与hsCRP、CCP正相关(P<0.05);ATG16表达水平与hsCRP、SJC正相关(P<0.05);Beclin-1表达水平与ESR、hsCRP、PtGA、DAS-28(ESR)正相关(P<0.05),与RF-IgG负相关(P<0.05);LC-3表达水平与ESR、hsCRP正相关(P<0.05)。治疗24周后,ATG5、LC-3、Beclin-1的mRNA表达水平均降低,ATG16的mRNA表达水平升高(P<0.05)。结论:自噬相关基因参与了RA发病;托法替布可能通过影响RA患者体内的自噬水平,可作为一种潜在的自噬调节剂。

受体酪氨酸激酶对子宫内膜异位症患者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

目的探讨受体酪氨酸激酶(Axl)对子宫内膜异位症(EMS)患者哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法收集5例卵巢EMS患者的在位内膜组织和异位内膜组织,另选择5例正常内膜组织作为对照。分离培养异位子宫内膜间质细胞(HEcESCs)、在位子宫内膜间质细胞(HEuESCs)及正常子宫内膜间质细胞(HEnESCs)并进行免疫组化鉴定,分析在细胞水平靶向上游Axl、mTOR激酶调控PI3K/AKT信号通路影响人类胚胎干细胞(HESCs)凋亡的机制。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证HEcESCs、HEuESCs及HEnESCs的Axl、mTOR mRNA的表达差异;在细胞水平选择siRNA转染调控Axl靶点,雷帕霉素调控mTOR靶点,采用蛋白质印迹法、qRT-PCR检测Axl、mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)及CyclinD1表达差异。结果与HEnESCs比较,HEuESCs及HEcESCs中Axl mRNA、mTOR mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,雷帕霉素处理组、Axl-siRNA处理组Axl mRNA、CyclinD1 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与雷帕霉素处理组相比,Axl-siRNA处理组中Axl mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组比较,雷帕霉素处理组Axl mRNA、CyclinD1 mRNA表达水平差异有统计学意义(P<0.05);与阴性对照组比较,Axl-siRNA处理组中Axl mRNA、CyclinD1 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,雷帕霉素处理组中mTOR mRNA相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。4组mTOR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,雷帕霉素处理组、Axl-siRNA处理组中p-mTOR、CyclinD1蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05),与阴性对照组的差异也有统计学意义(P<0.05)。结论调控Axl、mTOR可促进HEcESCs凋亡,Axl通过介导mTOR信号通路参与EMS的发生。

凝血因子Ⅷ、血小板反应蛋白1及可溶性Axl受体酪氨酸激酶在慢性肾小球肾炎患者中的表达情况及诊断价值

目的分析慢性肾小球肾炎(CGN)患者血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)、血小板反应蛋白1(TSP-1)及可溶性Axl受体酪氨酸激酶(sAxl)水平,并探讨三者对CGN的诊断价值。方法选取63例CGN患者作为研究组,55例健康体检者作为对照组。比较两组研究对象的一般临床资料,以及血浆FⅧ活性、TSP-1水平、sAxl水平。分析CGN患者血浆FⅧ活性、TSP-1水平和sAxl水平与肾功能的相关性。采用受试者工作特征曲线分析FⅧ、TSP-1及sAxl对CGN的诊断价值。结果与对照组相比,研究组患者的24 h尿蛋白水平、血尿素氮水平、血肌酐水平、血尿酸水平、血浆FⅧ活性、血浆TSP-1水平、sAxl水平均升高,肾小球滤过率(GFR)降低(均P<0.05)。CGN患者血浆FⅧ活性及TSP-1、sAxl水平与血尿素氮水平、血肌酐水平、血尿酸水平均呈正相关,与GFR均呈负相关(均P<0.05)。血浆FⅧ活性、TSP-1水平、sAxl水平单独检测及联合检测诊断CGN的灵敏度分别为87.30%、77.78%、85.71%、84.13%,特异度分别为56.36%、50.91%、58.18%、61.82%,曲线下面积分别为0.724、0.719、0.702、0.793。结论CGN患者血浆FⅧ活性及TSP-1、sAxl水平明显升高,且与肾功能具有一定相关性,三者联合检测对CGN具有较高的诊断价值。

脾相关酪氨酸激酶、蛋白激酶B、真核翻译起始因子4E、细胞周期蛋白依赖性激酶4在胃癌及癌前病变中的表达及相关性

目的探讨脾相关酪氨酸激酶(SYK)、蛋白激酶B(AKT)、真核翻译起始因子4E(EIF4E)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)在胃癌及癌前病变中的表达及相关性。方法收集90例患者的胃黏膜组织进行蛋白质印迹实验,其中癌旁正常组织30例,萎缩性胃炎组织30例,胃癌组织30例。另收集胃癌组织、萎缩性胃炎组织、癌旁正常组织存档蜡块各30例进行免疫组化实验。分别采用蛋白质印迹法和免疫组化法检测各组织中SYK、AKT、EIF4E、CDK4表达情况。分析萎缩性胃炎组织与胃癌组织中SYK、AKT、EIF4E、CDK4的相关性。结果癌旁正常组织中SYK蛋白表达水平及阳性表达率均高于萎缩性胃炎组织,萎缩性胃炎组织中SYK蛋白表达水平及阳性表达率均高于胃癌组织;癌旁正常组织中AKT、EIF4E、CDK4蛋白表达水平及阳性表达率均低于萎缩性胃炎组织,萎缩性胃炎组织中AKT、EIF4E、CDK4蛋白表达水平及阳性表达率均低于胃癌组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果显示,胃癌组织和萎缩性胃炎组织中SYK与AKT、EIF4E、CDK4表达均呈负相关(P<0.05),AKT、EIF4E、CDK4三者表达均呈正相关(P<0.01)。结论SYK、AKT、EIF4E、CDK4可能通过相互作用共同参与了胃癌的发生,其可能的机制与磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/AKT信号通路有关。SYK、AKT、EIF4E、CDK4有希望成为胃癌诊断和防治的靶标,检测SYK、AKT、EIF4E、CDK4对胃癌诊断、早期治疗及预防具有重要价值。

Src家族酪氨酸蛋白激酶对高糖环境中人LECs凋亡及EMT的影响

背景糖尿病性白内障是糖尿病的主要眼部并发症之一，包括皮质性、核性、囊膜下性及混合型白内障，其表型可能与晶状体上皮细胞（LECs）的不同病理改变有关，而糖尿病囊膜下性白内障是常见的表型之一。研究糖尿病囊膜下性白内障LECs的生物学行为对相关药物的研发和相关疾病的治疗有重要临床意义。目的探讨Src一家族酪氨酸蛋白激酶（SFKs）在高糖诱导的人LECs凋亡及上皮一间质转分化（EMT）中的作用。方法将人LECs系HLE-B3细胞分为正常对照组、高糖组和PPl组，分别在含5．5mmol／L葡萄糖的DMEM、含35．5mmol／L葡萄糖的DMEM及含35．5mmol／L葡萄糖＋10μmol／LSFK特异性抑制剂PPl的DMEM中培养24h。分别于细胞培养后3、6、12和24h采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率；用倒置显微镜观察各组细胞的形态学变化；采用免疫荧光染色检测细胞中EMT标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的相对表达量；并用Westernblot法检测p-Src^418（活化的c-Src激酶）及凋亡相关蛋白bcl-xl、survivin、caspase-3，EMT相关蛋白E-cadherin、d-SMA的表达变化。结果高糖组人LECs中p-Src^418的表达增高，并在培养6h时达峰值，正常对照组、高糖组和PPl组人LECs中p-Src^418的相对表达量（相对灰度值）分别为0．042±O．011、0．125±0．036和0．035±0．018，正常对照组和PPl组人LECs中p-Src^418的表达量明显低于高糖组，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。细胞培养后6、12和24h，高糖组人LECs凋亡率稍高于正常对照组，但差异均无统计学意义（均P〉0．05），PPl组人LECs凋亡率分别为（6．433±2．084）％、（10．333±2．610）％和（8．033±2．967）％，明显高于高糖组的（3．235±1．320）％、（3．533±1．159）％、（5．753±0．250）％及正常对照组的（3．133±1．170）％、（2．833±O．751）％、（3．333±1．201）％，差异均有统计学意义（均P〈0．05），而高糖组与正常对照组间比较差异均无统计学意义（均P〉O．05）。细胞培养后6h和12h，PPl组细胞中凋亡抑制蛋白bcl-xl、survivin的相对表达量（相对灰度值）明显低于高糖组和正常对照组，而凋亡促进蛋白caspase-3的相对表达量明显高于高糖组和正常对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。高糖组培养后24h，LECs呈梭形，发生纤维细胞样改变，PPl组纤维样细胞减少。Westernblot法检测和免疫荧光染色均显示，培养后6h高糖组细胞中EMT标志物E-cadherin蛋白的相对表达量低于PPl组和正常对照组，而α-SMA的相对表达量高于PPl组和正常对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论高糖环境可激活LECs中的c-Src激酶，进而诱导LECs发生EMT，同时LECs的凋亡减少；用PPl抑制c-Src激酶的异常激活有助于维持高糖环境中LECs的上皮特性。

Src酪氨酸蛋白激酶及其在高血压中的作用

高血压会导致一系列心脑血管结构和功能的变化,包括内皮功能的紊乱、血管张力的改变以及心脑血管重构等。最近有研究提示,Src酪氨酸蛋白激酶在高血压和脑卒中过程中发挥重要作用,其可能的机制包括通过影响氧化还原信号、偶联因子6、缓激肽、血管内皮生长因子和转化生长因子-β1等。该文将重点综述Src酪氨酸蛋白激酶通过不同作用机制调节血压的最新研究。

奥氮平介导环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/脑源性神经营养因子/酪氨酸蛋白激酶受体B通路对精神分裂模型大鼠的神经修复作用

目的 探讨奥氮平通过对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)/脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)通路的影响对精神分裂模型大鼠的神经修复作用。方法 将60只大鼠纳入对照组、模型组、奥氮平低、中、高剂量组,各组均10只。模型组、奥氮平低、中、高剂量组大鼠进行MK-801腹腔注射0.2 mg/(kg·d),对照组注射等量生理盐水。模型建立成功24 h后,奥氮平低、中、高剂量组分别以0.5、1.0、1.5 mg/(kg·d)奥氮平溶液灌胃,对照组、模型组同剂量生理盐水灌胃。按照共济失调和刻板行为标准对大鼠行为学进行评分;Morris水迷宫实验评定大鼠认知功能及学习能力;ELISA法检测大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平;观察海马组织病理学变化;检测海马区细胞凋亡及CREB/BDNF/TrkB通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组大鼠共济失调、刻板行为评分、TNF-α、IL-6表达、细胞凋亡率极显著增加(P<0.01),奥氮平低、中剂量组显著增加(P<0.05)。与对照组比较,模型组大鼠跨越平台次数、目标象限停留时间、CREB、磷酸化CREB(p-CREB)、磷酸化TrkB(p-TrkB)、TrkB、BDNF蛋白相对表达极显著减少(P<0.01),奥氮平低、中剂量组显著减少(P<0.05)。与模型组比较,奥氮平低、中剂量组跨越平台次数、目标象限停留时间显著增加(P<0.05),奥氮平高剂量组极显著增加(P<0.01)。模型组以及奥氮平低剂量组中海马细胞肿大明显、细胞核破碎分裂、固缩,组织排列杂乱;奥氮平中、高剂量组大鼠海马细胞中少见破碎分裂以及核固缩现象,整体组织与对照组大鼠相似。结论 奥氮平对精神分裂症模型大鼠的神经修复作用机制涉及到改善大鼠认知功能受损、保护大鼠海马神经细胞以及激活CREB/BDNF/TrkB信号通路的表达。

Tec家族蛋白酪氨酸激酶Itk PH结构域与OS-9蛋白的相互作用

用酵母双杂交技术筛选与ItkPH结构域相互作用的蛋白分子 ,以了解Itk的功能及其在T细胞信号转导中的位置与作用 .Itk的PH结构域扩增后克隆入酵母双杂交系统的pLexA载体 ,转化酵母细胞EGY4 8(p8op lacZ) ,经检测PH结构域无自激活作用 ,且对酵母细胞无毒性作用 .用PH结构域作为“钓饵”蛋白 ,在酵母双杂交系统中筛选构建于AD载体的T细胞cDNA文库 .将PH结构域及筛库所得基因片段分别进行融合表达 ,用于体外结合实验 ,进一步证实二者的相互作用 .经营养缺陷选择、诱导筛选和鉴定确证 ,筛库所得的插段约 15 0 0bp的文库质粒为一真阳性克隆 .经blast比较分析为骨肉瘤、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中高表达的os 9基因 .体外结合实验也表明 ,ItkPH结构域可与该基因表达产物结合 .Itk的PH结构域可与OS 9蛋白相互作用 .

Eph/Ephrin-B1通过Src酪氨酸激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号抑制睫状神经节神经元的尼古丁乙酰胆碱受体电流

本研究旨在探讨Eph/Ephrin-B1信号对急性分离的鸡胚睫状神经节(ciliary ganglion,CG)神经元上α3-尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,α3-nAChRs)和α7-尼古丁乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChRs)电流的影响及可能机制。用膜片钳技术在急性分离的CG神经元上分别记录α3-nAChRs和α7-nAChRs全细胞电流。为检测Ephrin-B1对细胞nAChRs电流的影响,细胞被随机分为:对照组、Ephrin-B1Fc处理组(用Ephrin-B1与IgG重组后形成的Ephrin-B1Fc刺激细胞)、IgG处理组(用与Ephrin-B1Fc处理组重组所需的相同浓度的IgG刺激细胞)和Ephrin-B1处理组(用与Ephrin-B1Fc处理组重组所需的相同浓度的Ephrin-B1刺激细胞)。为探讨Ephrin-B1调节细胞nAChRs电流的机制,分别用Src信号抑制剂PP2和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号抑制剂PD98095预处理细胞后,再用Ephrin-B1Fc处理细胞,观察α3-nAChRs和α7-nAChRs电流的变化,细胞被随机分为:对照组、Ephrin-B1Fc处理组、PP2或PD98095(PP2/PD)处理组、Ephrin-B1Fc+PP2或PD98095处理组。结果显示:对照组、IgG处理组和Ephrin-B1处理组之间α3-nAChRs和α7-nAChRs电流无显著差异,而Ephrin-B1Fc处理组可显著抑制α3-nAChRs和α7-nAChRs电流,与对照组比较有显著差异(P=0.002、P=0.003);此外,PP2可部分恢复被Ephrin-B1Fc所抑制的α7-nAChRs电流,PD98095则可部分恢复被Ephrin-B1Fc所抑制的α3-nAChRs电流。以上结果提示,Eph/Ephrin-B1信号可能分别通过MAPK和Src信号途径抑制急性分离的CG神经元上α3-nAChRs和α7-nAChRs的电流,表明Eph/Ephrin-B1可能参与交感神经系统功能的调控。

体外Src蛋白酪氨酸激酶抑制剂筛选模型的建立

在体外构建一个以Src蛋白为靶位点的蛋白酪氨酸激酶抑制剂快速筛选模型,为筛选Src蛋白酪氨酸激酶抑制剂奠定基础.基因工程表达GST-v-Src蛋白,收集包涵体蛋白,并经变性复性处理.以生物素化的聚Glu∶Tyr(4∶1)为激酶反应底物、以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的磷酸酪氨酸特异性单克隆抗体(HRP-PY20)检测磷酸酪氨酸残基的酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定获得蛋白的激酶活性,并进行抑制剂筛选.该模型具有靶向性强、快速、简便可行、高通量的特点.用该方法对6种治疗肿瘤配方中常用的中草药进行筛选,筛选出3种中草药水煎剂富含Src蛋白酪氨酸激酶抑制剂成分.

含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2活性的影响

目的:探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响。方法:健康雄性SD大鼠160只被随机分为五组(对照组、模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP组),每组32只。除对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液)外,其余四组构建四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型,并将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP及靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP自大鼠尾静脉分别注射入Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠,各组分别于造模第2、4、6、8周选取8只大鼠留取肝组织标本。采用HE染色观察大鼠肝组织病理学变化;采用Masson三色染色检测大鼠肝组织胶原沉积;采用实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织SHP2、ERK1 mRNA表达;采用免疫组织化学染色检测SHP2蛋白表达;采用Western blot检测ERK1和p-ERK1蛋白表达。结果:大鼠肝纤维化模型成功构建,在各造模时间点,与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织胶原沉积比较,Ad-SHP2组均加重,而Ad-shRNA/SHP2组均减轻。导入野生型SHP2基因后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显升高(均P<0.05),而导入靶向SHP2的shRNA后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显降低(均P<0.05)。在各造模时间点(第2、4、6、8周),模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠肝组织ERK1 mRNA及蛋白表达以及p-ERK1蛋白表达高于对照组(均P<0.05),但上述四组大鼠肝组织的ERK1 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05);而在各时间点与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织p-ERK1蛋白表达比较,Ad-SHP2组升高(均P<0.05),Ad-shRNA/SHP2组降低(均P<0.05),模型组与Ad-GFP组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:大鼠纤维化肝组织中SHP2过表达可通过促进ERK1/2磷酸化增强ERK1/2活性,而SHP2低表达则可通过抑制ERK1/2磷酸化降低ERK1/2活性。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂联合FMS样酪氨酸激酶-3抑制剂对FLT3-ITD突变白血病细胞增殖、凋亡和周期的影响

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)联合FMS样酪氨酸激酶-3(FLT3)抑制剂对FLT3-ITD突变的急性髓系白血病(AML)细胞系增殖抑制作用及其相关机制。方法 将西达本胺(Chidamide)和奎扎替尼(Quizartinib,AC220)以不同浓度单药或联合作用于MV4-11、MOLM-13细胞系48 h后,CCK8检测细胞增殖能力;Compusyn 1.0软件分析两药联合作用的协同效应;流式细胞计数法测定各组细胞凋亡率、增殖周期;蛋白质印迹法测定P53、Bcl-2、Bax、FLT3、磷酸化FLT3(p-FLT3)及磷酸化AKT(p-AKT)蛋白表达水平。结果 随西达本胺及奎扎替尼单药或联合作用浓度升高,对MV4-11及MOLM-13细胞系的48h增殖抑制率均显著升高(P<0.05),并且两药具有协同抑制效应(均CI值<1)。在奎扎替尼1.0 nmol/L+西达本胺1.0μmol/L作用48 h后,细胞凋亡率MV4-11细胞株为31.697%±5.648%,MOLM-13细胞株为18.500%±1.751%,细胞周期阻滞于G0/G1期的比例MV4-11细胞株为78.493%±1.285%,MOLM-13细胞株为89.850%±1.072%,两药联合较奎扎替尼1.0 nmol/L或西达本胺1.0μmol/L单药使用可明显促进MV4-11及MOLM-13细胞系的凋亡和周期阻滞(P<0.05)。奎扎替尼1.0 nmol/L联合西达本胺1.0μmol/L治疗较单药能更明显上调P53、BAX促凋亡蛋白,下调p-FLT3、抗凋亡蛋白BCL-2及PI3K/AKT信号通路关键下游因子p-AKT。结论 西达本胺与奎扎替尼联合应用可通过下调p-FLT3、p-AKT、Bcl-2蛋白表达,上调P53、Bax蛋白表达,促进FLT3-ITD突变白血病细胞系的凋亡及周期阻滞,抑制AML细胞的增殖活性。