大鼠坐骨神经切断后Src抑制的蛋白激酶C的底物的表达变化

目的探讨大鼠坐骨神经切断后,Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)在神经中的表达变化及其意义。方法制备成年SD大鼠坐骨神经切断模型。通过Western blotting和免疫组织化学方法检测坐骨神经切断后SSeCKS表达的时空变化。结果Western blotting显示,大鼠坐骨神经切断后,近端SSeCKS的表达逐步升高,伤后2d达到高峰,之后逐渐下降。远端SSeCKS表达于12h达到高峰,之后呈下降趋势。免疫组织化学方法结果表明,SSeCKS在神经断端处高表达,成簇状聚集;在远离断端处表达明显降低,分布亦较为均一。免疫荧光双标记结果显示,SSeCKS与S100、NF200及GAP43有部分共定位。结论大鼠坐骨神经切断后,可以引起SSeCKS的表达变化,其可能参与周围神经损伤后某些伤害性刺激信号分子的转导,并与损伤后神经的再生及功能修复有关。

大鼠坐骨神经损伤后Src抑制的蛋白激酶C的底物在背根神经节中的表达变化

目的:探讨大鼠坐骨神经损伤后,Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)在背根神经节(DRG)中的表达变化及其意义。方法:制备成年SD(Sprague-Dawley)大鼠坐骨神经夹伤及切断模型。通过Western印迹法、Real-time PCR及免疫组织化学方法检测坐骨神经损伤后SSeCKS在DRG中表达的时空变化。结果:大鼠坐骨神经夹伤后6h,DRG中可检测到SSeCKS的表达并逐步升高,伤后12h达到高峰,2d后逐渐下降;而大鼠坐骨神经切断后DRG中SSeCKS的表达高峰发生在伤后2周,1d时最低;SSeCKS主要分布于DRG大、中、小神经元胞质;SSeCKS与NeuN、NF200以及GAP43存在共定位。结论:大鼠坐骨神经损伤后,引起DRG中SSeCKS的表达变化,其可能参与疼痛信号转导通路并与周围神经损伤后的再生有关。

Src抑制的蛋白激酶C的底物在脑组织中的表达

目的:探讨大鼠发育过程中,SSeCKS(Src抑制的蛋白激酶C的底物)在脑组织中的表达变化及意义。方法:通过Western blot,免疫组织化学法检测SSeCKS在脑组织中表达的时空变化及细胞定位。结果:SSeCKS在大鼠脑发育过程中存在明显的表达变化,在胎鼠和生后早期的SD大鼠中表达水平较高,尤以生后1周明显,成年以后显著降低,4周时最低。脑分区检测显示端脑、海马和间脑符合全脑检测结果。DAB显色示SSeCKS在脑组织中呈点状散在分布,免疫荧光双标记示SSeCKS与星形胶质细胞有部分共定位,与神经元无明显共定位。结论:SSeCKS在大鼠脑发育过程中存在时空变化,并且主要定位于星形胶质细胞。提示SSeCKS可能通过参与细胞骨架的调节和信号通路的活化影响大鼠胚胎发育过程中星形胶质细胞指导的神经元的迁移和轴突的生长。

细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

目的研究细菌脂多糖(LPS)对培养的大鼠星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)表达的影响。方法培养的星形胶质细胞随机分为空白对照组、LPS单一刺激组、LPS联合PKC抑制剂(RO-31-8220)刺激组。运用荧光定量PCR(Real time RT-PCR)、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位。结果Real time RT-PCR显示,LPS可以上调SSeCKS mRNA水平,在作用浓度为100μg/L和1 mg/L时与对照组有显著差异(P<0.01)。Western blotting表明,当LPS作用浓度为100μg/L时,SSeCKS蛋白表达量明显上调;在此浓度作用下,SSeCKS表达于6 h达高峰并广泛磷酸化,至24 h其蛋白表达仍维持于较高水平。免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于胞质,于胞膜略有浓集。在LPS单一刺激组,SSeCKS富集于核周;当LPS联合RO-31-8220共同作用时,SSeCKS的亚细胞定位与正常组无明显差异。结论在体外培养的星形胶质细胞中,LPS可诱导SSeCKS表达,上调其磷酸化水平,影响其细胞内定位。这些改变与PKC的功能相关。提示SSeCKS可能参与星形胶质细胞中炎症信号的转导。

高体积分数氧致新生大鼠肺组织毛细血管内皮细胞中Src抑制的蛋白激酶C的底物的表达及亚细胞定位变化

目的观察高体积分数氧(高氧)暴露时新生大鼠肺组织毛细血管内皮细胞中Src抑制的蛋白激酶C(PKC)的底物(SSeCKS)的表达及亚细胞定位的变化。方法出生12 h内大鼠128只按照随机数字表法分为4组:空气对照组、高氧暴露组、高氧暴露加蛋白激酶C抑制剂(R031-8220)组、高氧暴露加9 g/L盐水组。空气对照组置于空气中,余3组均置于常压高氧仓中,氧体积分数>950 mL/L,高氧暴露加R031-8220组自高氧暴露第1天起,腹腔注射5×10-2g/(kg.d)R031-8220,连续72 h;高氧暴露加9 g/L盐水组自高氧暴露第1天起,腹腔注射9 g/L盐水0.2 mL/(kg.d),连续72 h。于高氧暴露12、24、48和72 h时相点处死动物,在高氧暴露72 h行肺组织的病理学检查及肺湿/干质量比值(W/D)检测,应用免疫荧光双标法观察肺组织毛细血管内皮细胞SSeCKS的表达并通过IPP6.0软件对结果进行分析。采用SPSS13.0统计软件分析数据。结果高氧暴露组72 h时相点新生大鼠肺泡内可见大量红细胞,肺泡间隔增宽,粒细胞浸润;高氧暴露加R031-8220组新生大鼠肺组织病理改变较高氧暴露组明显减轻。与空气对照组比较,高氧暴露组W/D增加(t=9.223 P<0.01);与高氧暴露组比较,高氧暴露加R031-8220组W/D降低(t=5.050P<0.01)。72 h时相点其肺组织毛细血管内皮细胞SSeCKS的表达及亚细胞位置的变化:空气对照组SSeCKS主要分布在细胞膜;与空气对照组比较高氧暴露组SSeCKS表达增加,且有非常显著性差异(t=8.861 P<0.01),主要表达在细胞质中,高氧暴露加R031-8220组SSeCKS表达与高氧暴露组比较明显减少,有非常显著性差异(t=9.863 P<0.01),SSeCKS主要表达在细胞膜。结论新生大鼠肺组织毛细血管内皮细胞SSeCKS的变化参与高氧致新生大鼠肺组织毛细血管损伤的病理过程。

Src抑制的蛋白激酶C底物在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓中的表达及其意义

目的研究Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)进程中的表达情况,探讨其在EAE病理过程中可能的功能及意义,为多发性硬化(multiple sclerosis,MS)和EAE提供新的治疗靶点。方法构建EAE大鼠模型,进行临床打分评估;用HE染色检测EAE大鼠脊髓组织的炎性浸润情况;用western blot检测SSeCKS的表达变化;用免疫组织化学观察SSeCKS在脊髓组织中的分布。结果髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)诱导单相的EAE过程:Lewis大鼠经MBP免疫后7～10d开始有临床症状,13～16d达到发病高峰,之后自发地恢复,至30d左右恢复到病前水平;EAE病程高峰期,大鼠脊髓炎性浸润情况显著;SSeCKS蛋白表达在EAE起始E1期显著增加,E3期达到高峰,之后开始下降,恢复期基本恢复到正常水平。结论本实验成功构建了Lewis大鼠的EAE模型;EAE病理过程中,SSeCKS蛋白表达水平发生变化,提示SSeCKS可能参与了EAE过程。

长期饮酒后肺损伤大鼠Src抑制的蛋白激酶C底物的变化

目的探讨长期饮酒对大鼠内外源性肺损伤时Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS)的影响。方法 SD雄性大鼠36只,随机分为单纯饮酒组、饮酒内源性肺损伤组、饮酒外源性肺损伤组、单纯饮水组、饮水内源性肺损伤组和饮水外源性肺损伤组,每组6只。采用实时PCR法测定肺组织SSeCKSmRNA表达变化,比较各组上述指标是否存在差异。结果单纯饮酒组肺组织SSeCKSmRNA表达较饮水组增多(P<0.05),饮酒内、外源性肺损伤各组较饮水内、外源性肺损伤各组增多显著(P<0.05),饮酒内、外源性肺损伤组之间表达无统计学差异(P>0.05)。结论 SSeCKS表达增加是长期饮酒引起急性呼吸窘迫综合征(actue respiratory distress syndrome,ARDS)的易感性增加和病情严重的可能机制之一。

蛋白激酶C及其抑制物在肺癌中的活性表达及临床意义

目的 对肺癌及相应的肺癌旁组织标本中蛋白激酶C(PKC)及其抑制物 (PKCI)的活性表达规律进行对照研究。方法 收集 2 6例肺癌及癌旁组织标本 ,通过检测同位素放射来测定标本胞浆和胞膜中PKC的比活性和PKCI对PKC活性抑制百分数。结果 2 6例肺癌组织细胞胞浆中PKC比活性显著高于癌旁组织 (P <0 .0 1) ;而非小细胞癌胸膜中PCK比活性明显低于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,小细胞癌胞膜中PKC比活性与癌旁组织无明显差异 (P <0 ,0 5 )。另外 ,2 6例肺癌组织胞浆中PKCI的抑制活性明显低于癌旁组织 (P <0 .0 5 ) ,而胞膜中PKCI的抑制活性则与癌旁组织无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 肺癌组织中PKC被激活而活性增高 ,同时PKCI表达降低说明其对PKC的调控能力下降 ,以上表明PKC和PKCI可能在肺癌的发生及发展中起重要作用。

口腔鳞癌组织中蛋白激酶C及其抑制物活性的研究

目的：探讨口腔鳞癌发生的分子生物学机理。方法：采用Ｔａｋａｉ法研究２０例口腔鳞癌及其临近正常组织的蛋白激酶Ｃ（ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）及其抑制物（ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＫＣＩ）活性。结果：与临近正常组织相比口腔鳞癌胞浆ＰＫＣ活性明显升高（Ｐ＜０．０１），而胞膜无明显变化（Ｐ＞０．０５）；与临近正常组织相比口腔鳞癌胞浆ＰＫＣＩ活性明显降低（Ｐ＜０．０１），而胞膜无明显变化（Ｐ＞０．０５）。结论：口腔鳞癌的发生与ＰＫＣ及ＰＫＣＩ在亚细胞水平活性变化密切相关。

喉癌与蛋白激酶C及其抑制物的关系

为了探讨喉癌与蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）及其抑制物（ＰＫＣＩ）的关系。应用Ｔａｋａｉ蛋白浓度梯度，通过同位素放射性活性测定ＰＫＣ活性及测定ＰＫＣＩ对ＰＫＣ活性抑制的百分数。结果为癌组织胞浆中ＰＫＣ比活性（６６３±０６４ｐｍｏｌ·ｍｇ－１·ｍｉｎ－１）显著高于正常组织胞浆中ＰＫＣ比活性（４．７３±０．５４ｐｍｏｌ·ｍｇ－１·ｍｉｎ－１），癌组织胞浆中ＰＫＣ抑制活性（３３．６％±７．６４％）显著低于正常组织胞浆中ＰＫＣＩ抑制活性（６１．３％±７．９１％）。结果提示癌组织中ＰＫＣ活性升高很可能是被癌基因激活。

小鼠受精卵中蛋白激酶C底物的鉴定

为研究蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)在小鼠早期发育中的调节作用,运用超排卵和体外受精技术,采用体外磷酸化和放射自显影的方法,鉴定小鼠1-细胞期受精卵中PKC的底物。经特殊的反复冻融处理,消除卵中内源性蛋白激酶活性。55个受精卵的样品中加入部分纯化的PKC,结合应用较强的PKC抑制剂H-7和星形孢菌素以及促分裂原活化蛋白激酶抑制剂PD098059作为对照,观察到12条PKC底物蛋白的放射自显影带,根据标准蛋白质Rf值绘制的标准曲线计算,这些磷酸化蛋白的相对分子量分别约为120kDa、100kDa、79kDa、63kDa、59kDa、47kDa、40kDa、34kDa、32kDa、26kDa、24kDa和22kDa。实验结果表明,PKC可通过底物蛋白活性的调节,在小鼠早期发育中发挥重要作用。

白血病细胞中蛋白激酶C底物的研究

白血病细胞ｉｎｖｉｖｏ蛋白质磷酸化实验结果表明，当ｆＭｅｔ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ三肽或促癌剂ＴＰＡ作用到白血病细胞使ＰＫＣ活化时，活化的ＰＫＣ可特异地促进白血病细胞中包括分子量为４０ＫＤ蛋白质在内的三种蛋白质磷酸化。这三种蛋白质的磷酸化反应，可被抗癌药物硫杂脯氨酸衍生物所抑制。

钙-钙调蛋白与蛋白激酶C在底物共享结构域中的聚集及其意义

本文从以下几个方面较为系统地阐述了钙 -钙调蛋白 (Ca2 +- Ca M)和蛋白激酶 C(PKCs)在底物的共享结构域中聚集现象的研究现状 :1 Ca M贮存蛋白 (如神经颗粒素 NG、神经调节素 NM)的分布 ;2 Ca M和 PKCs到达共享结构域的相对时间 ;3突触后 Ca M和

灯盏花提取物对心脏移植异基因大鼠蛋白激酶C的作用

目的:利用异基因大鼠心脏移植模型研究中药灯盏花提取物对蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的抑制作用。方法:以Wistar大鼠为供体,SD大鼠为受体,建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,分为灯盏花提取物低剂量组(5mg·kg-·1d-1)、中剂量组(10mg·kg-·1d-1)、高剂量组(15mg·kg-·1d-1)和对照组。移植术后各实验组受体腹腔注射药物至移植心停跳。用底物磷酸化激酶测定法检测受体外周血淋巴细胞PKC的活性并用Westernblot印迹法鉴定;用酶联免疫吸附法检测受体外周血液中白细胞介素-2(IL-2)的水平。结果:各实验组受体外周血淋巴细胞PKC活性及表达和IL-2的水平明显较对照组低。结论:在异基因大鼠心脏移植中灯盏花提取物可对PKC的活性产生抑制作用。

补阳还五汤有效组分对血管内皮细胞抗血栓功能及蛋白激酶C的影响

目的探讨补阳还五汤及其有效组分生物碱、苷对凝血酶诱导的血管内皮细胞抗血栓功能改变及蛋白激酶C(PKC)活化的影响。方法以凝血酶(10 U/mL)作用于培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304),同时加入药物,24 h后测定上清液中组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)水平、细胞组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、凝血酶调节蛋白(TM)mRNA表达及PKCα蛋白表达。结果凝血酶作用内皮细胞后,tPA释放增加(P<0.01),TF、TFPI mRNA表达增强(P<0.05),而PAI-1释放及TM mRNA表达无显著性变化(P>0.05);PKCα表达增强(P<0.05)。补阳还五汤可抑制凝血酶诱导的tPA释放增加(P<0.01),生物碱对tPA释放增加无显著影响(P>0.05);苷(1.25 mg/mL)可使凝血酶诱导的tPA分泌增加(P<0.05);原方、生物碱(2 mg/mL)和苷(5 mg/mL)均可抑制内皮细胞分泌PAI-1(P<0.01)。原方、生物碱(1,2 mg/mL)和苷均可抑制凝血酶诱导的TF mRNA表达增强;生物碱(0.5和1 mg/mL)可抑制TFPI mRNA表达(P<0.05);各药对TM mRNA表达无显著影响;原方、生物碱和苷均可抑制凝血酶诱导的内皮细胞PKCα表达的增强(P<0.01)。PKC激活剂佛波酯(PMA)刺激内皮细胞后,PKCα被激活(P<0.01);PKC抑制剂H7作用于PMA刺激的内皮细胞后,PKCα表达增强不明显,PAR-1受体抑制剂CATG作用于凝血酶刺激的ECV304细胞后,PKCα表达显著抑制(P<0.05)。结论凝血酶可诱导内皮细胞抗血栓性发生变化。补阳还五汤原方、生物碱和苷对凝血酶诱导的血管内皮细胞抗凝、纤溶功能的改变具有调节作用,使血管内皮细胞的抗凝、纤溶作用趋于正常,其作用可能主要是通过抑制凝血酶诱导的PKCα的激活而介导的。生物碱和苷类有效组分可能为该方抗血栓作用的药效物质基础。

兔心肌细胞蛋白质中可能的PKCε直接底物的鉴定

目的 :利用PKCε酶促放射性磷酸化标记兔心肌细胞蛋白质 ,鉴定出其可能的直接底物 ,为进一步研究奠定基础 .结果 :通过PKCε特异底物竞争抑制、PKCε特异抑制剂Ro 31- 82 2 0、兔心肌细胞蛋白质热变性等分析措施 ,初步用PKCε酶促放射性磷酸化标记 ,从兔心肌细胞蛋白质中鉴定出表观分子量为 5 7kd ,35kd ,2 3kd和 2 0kd的蛋白质的磷酸化与PKCε酶活性相关 ,其中 5 7kd ,2 3kd和 2 0kd 3种蛋白质可被PKCε在体外直接磷酸化 ,并且其磷酸化不受蛋白激酶抑制剂PD980 5 9和SB2 0 35 8的影响 .结论 :5 7kd ,2 3kd和2 0kd 3种蛋白质有可能是PKCε直接底物 .

src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α

目的探讨8re抑制的蛋白激酶c底物（SSeCKS）对脂多糖（LPS）诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α的影响。方法体外培养Wistar大鼠PMVEC，按随机数字表法分组（n=4），10mg／LLPS刺激1h、3h、6h、12h、24h或0．1mg／L、1mg／L、10mg／LLPS刺激24h；蛋白激酶C抑制剂（BIM）预处理0．5h或50nmol／LSSeCKS-siRNA转染PMVEC48h后再加入10mg／LLPS孵育24h，酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α 量（ng／L）。采用SPSSl0．0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P〈0．05为差异具有统计学意义。结果0．1、1、10mg／LLPS刺激PMVEC24h后的，TNF-α分泌量分别为（253．70±23．55）、（327．88±37．25）、（403．204-36．22）ng／L，均高于未刺激组（82．28±22．56）ng／L（均P=0．000）；10mg／LLPS刺激PMVEC后，TNF-α分泌量于1h升高（170．11±49．22）ng／L，6h达峰值（404．82±13．78）ng／L，刺激24h后仍维持高水平（395．67±36．23）ng／L，分别与未刺激组（84．60±23．61）ng／L比较：P=0．001，0．000，0．000；BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激，TNF-α分泌量（200．44±27．39）ng／L较LPS单独刺激（402．28±31．07）ng／L显著较少（P=0．000）；与LPS单独刺激比较（407．28±32．64）ng／L，SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后，LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应（195．20±13．28）ng／L也显著下降（P=0．000）。结论下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，从而减轻PMVEC的炎症反应。

血小板活化因子诱导大鼠肺微血管内皮细胞Src抑制的蛋白激酶C底物基因表达

目的研究血小板活化因子（PAF）对大鼠肺微血管内皮细胞（RPMVEC）中Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKs）mRNA表达的影响及其信号转导途径。方法体外培养RPMVEC，采用细胞原位杂交技术检测不同刺激条件下RPMVEC中SSeCKsmRNA的表达变化。结果正常RPMVEC中有少量SSeCKSmRNA表达，为棕黄色细颗粒状杂交信号，分布于胞质；用10^-10、10^-9、10^-8、10^-7mol／L的PAF分别孵育RPMVEc1．5h，SSeCKSinRNA表达随其浓度增加而升高（分别为0．0549±0．0007、0．0599±0．0018、0．0690±0．0018、0．0754±0．0019），与正常对照组（O．0368±0．0037）比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）；10^-7mol／LPAF刺激RPMVEC0．5、1．5、3、6、12、24h，SSeCKS mRNA表达水平于0．5h即显著升高（0．0710±0．0015），1．5h达峰值（0．0756±0．0017），之后逐渐下降，24h时（0．0439±0．0010）仍高于正常对照组（0．0382±0．0041，均P〈0．05）；10／lmol／L核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二巯基氨甲酸（PDTc）预处理RPMVEC1h可显著下调PAF对SSeCKSmRNA的诱导效应（0．0497±0．0032比0．0719±0．0019，P〈0．05），而蛋白激酶C（PKC）抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺（BIM）预处理RPMVEC0．5h则不影响此效应（0．0697±0．0021比0．0719±0．0019，P〉0．05）。结论PAF呈浓度和时间依赖的方式上调RPMVEC中SSeCKS基因转录；NF-κB信号通路而非PKC参与了PAF的诱导效应。

Src抑制的蛋白激酶C底物与炎性肺组织损伤

Src抑制的蛋白激酶C底物是一种新发现的细胞支架蛋白，亦是一种脂多糖反应蛋白，和炎症反应密切相关，可能参与了炎症所致的肺组织损伤。它和炎症所致肺血管损伤相关信号转导机制有着密切的关系，如蛋白激酶C、酪氨酸蛋白激酶、G蛋白耦联受体相关的信号通路，可能具有调节血管通透性的作用。通过对其的研究，能为急性肺损伤的防治提供新的理论依据。