葡萄球菌A蛋白基因的克隆及其IgG受体区新型表达载体的构建

旨在克隆SPA基因并将该基因的IgG结合区亚克隆至毕赤酵母表达载体中。以金黄色葡萄球菌CowanI菌株基因组为模板,对葡萄球菌A蛋白(SPA)基因全长序列进行PCR扩增,再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒,将DNA测序所得的结果用Blastn软件进行在线同源比对,经鉴定为SPA基因序列后,在线对其进行功能区域(IgG-Fc受体区)的预测,将该区域亚克隆入表达载体pPICZaA。结果显示,从CowanI菌株中成功地扩增到SPA基因,与NCBI中公布的序列同源性高达97%。

金黄色葡萄球菌eap基因的克隆与表达

目的构建携带eap基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组EAP融合蛋白。方法PCR法扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA,回收、纯化的扩增产物与pMD18-T载体相连接得重组质粒pMD18-T-EAP,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒pMD18-T-EAP和pET28a(+)表达载体分别用NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切、连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度1、2、4、8mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用MagneHis-蛋白纯化系统纯化重组EAP融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。结果所获eap基因与GeneBank的基因序列同源性>99%;氨基酸同源性达100%。重组质粒经IPTG诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A)值等于0.6～0.8时,相对分子质量约70000处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度1mmol/L为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG诱导1h重组EAP融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3h时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组EAP融合蛋白含量占全菌体蛋白的29.6%。结论成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组EAP融合蛋白,为进一步研究以EAP蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。

金黄色葡萄球菌IsdD基因的克隆与表达

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌,IsdD属于金黄色葡萄球菌Isd系统中的重要成员。本研究根据Gen-Bank报道的金黄色葡萄球菌IsdD基因序列设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增出目的片段Is-dD,将其用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+-)IsdD。序列分析结果显示,目的基因序列与网上的IsdD序列相比核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98%以上。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中并成功诱导表达出大小为61.3ku的蛋白,这为下一步研究IsdD蛋白的结构和功能奠定了良好基础。

金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3编码区克隆及其植物表达载体构建

金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌,其表面的纤连素结合蛋白(FnBP)在介导金黄色葡萄球菌侵入寄主细胞的过程中发挥着重要作用。因此,FnBP成为奶牛乳腺炎亚单位疫苗研究中的重要靶标。本研究根据Genbank中纤连素结合蛋白B基因(fnbB)D区编码序列设计引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,PCR扩增D2-D3区,将该片段回收后与pCAMBIA3301植物表达载体同时进行NcoⅠ和Eco 065Ⅰ(BstEⅡ)双酶切,酶切片段回收后进行连接,将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,通过菌落PCR、酶切鉴定等方法筛选阳性克隆,将阳性克隆送公司测序确定DNA序列。结果表明,阅读框架正确,氨基酸序列无突变,成功构建金黄色葡萄球菌fnbB基因D2-D3区植物表达载体。该研究为研制奶牛乳腺炎转基因植物口服疫苗奠定了基础。

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌临床分离株青霉素结合蛋白2a的克隆表达及鉴定

目的 应用基因重组技术对编码甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因片段进行克隆、表达。方法 从临床样本巾分离鉴定出MRSA，根据基因文库收录的mecA基因编码序列，针对编码PBP2a第25～668位氨基酸的mecA基因片段设计引物，扩增目的基因片段，克隆至pQE30载体，经酶切鉴定、测序后，再转化E．coliM15（pREP4）。采用1mmol／L的异丙硫半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达及鉴定。结果重组表达质粒pQE30-mecA构建成功，基因测序结果显示，扩增的mecA基因DNA片段全长为1932bp，其巾有9个碱基突变。IPTG诱导后6h，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，M15（pQE30-mecA）出现一条相对分子质量约74×10^3的蛋白条带，且一部分以可溶性形式存在；M15（pQE30）未出现特异性蛋白条带。经诱导表达和鉴定证实，表达出的可溶性目的蛋白为PBP2a。结论 利用本技术可成功表达MRSA临床分离株中的可溶性PBP2a。

云芝免疫调节蛋白基因克隆及酵母重组表达

真菌免疫调节蛋白(Fip)是真菌中重要的药理成分之一。为进一步开发真菌中Fip资源,从云芝中克隆了云芝免疫调节蛋白基因Fip-cve,对Fip-cve的理化性质和生物信息学进行了研究,并将其转入酵母表达载体中,成功获得了酵母转化子。结果表明:Fip-cve基因扩增片段长为336 bp,该序列编码111个氨基酸;Fip-cve蛋白的二级结构是以无规卷曲为主,同时含有35.71%的延伸链,还含有12.35%的α-螺旋,主要位于N端;疏水性分析表明该基因编码的蛋白是亲水性蛋白,二级结构分析也解释了该蛋白的结构特征;SDSPAGE电泳结果显示Fip-cve目的蛋白均在酵母中获得了高效表达,目的蛋白分子量约为13 ku;生物信息学分析结果表明,Fip-cve与灵芝属真菌免疫调节蛋白具有很高的同源性,特别是与小孢灵芝具有更高的同源性。该研究初步建立了Fip-cve的真核表达体系,以期为Fip-cve的进一步开发提供参考。

金黄色葡萄球菌ymdB基因的克隆表达及生物信息学分析

[目的]克隆、表达金黄色葡萄球菌ymd B基因,并对其编码产物进行生物信息学分析。[方法]以金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌株的基因组DNA为模板,用聚合酶链式反应扩增ymd B基因,将扩增基因酶切后与表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒并转化大肠杆菌TG1,增菌培养后提取质粒,经PCR、基因测序鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后,进行10%SDS-PAGE分析。使用Protparam、PSORT、CDD、Signal P 4. 1、TMpred、Net Phos 3. 1 Server、PSIPRED、SWISS-MODEL等软件,分析YmdB蛋白的氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、带电荷氨基酸总数、半衰期、稳定性、疏水性、亚细胞定位、保守结构域、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、二级结构、三维结构等。[结果]构建了表达载体pET-32a(+)-ymd B,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达。YmdB蛋白由266个氨基酸组成,相对分子质量为30134. 53Da,等电点为6. 23,正电荷氨基酸总数为33个,负电荷氨基酸总数为35个,在大肠杆菌内的半衰期为10 h以上,是稳定的亲水蛋白质,定位于细胞质中,与YmdB蛋白家族具有相似的保守结构域,没有信号肽,有一个跨膜区和14个磷酸化位点,二级结构中ɑ螺旋、β折叠和无规则卷曲分别占42. 11%、9. 40%、48. 49%,三维空间结构与二级结构预测结果大致相同。[结论]成功克隆、表达了金黄色葡萄球菌ymdB基因,并对YmdB蛋白进行了生物信息学分析,为深入研究该蛋白的分子作用机理打下一定基础。

金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白PBPX基因的克隆与表达

[目的]对金黄色葡萄球菌一种新的青霉素结合蛋白(PBPX)进行原核表达,为新型抗菌药物设计提供参考数据。[方法]将ATCC25923基因组数据通过Blast进行比对,从中发现了一个含有PBP保守结构域的基因序列,命名为PBPX。PCR扩增PBPX基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体p ET-32a(+)连接,构建表达PBPX的重组质粒,将该重组质粒转化大肠杆菌TG1内,增菌培养后提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后,再转化大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株诱导后进行10%SDS-PAGE分析。[结果]构建了表达载体p ET-32a(+)-PBPX,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后获得表达,重组青霉素结合蛋白分子量为52. 2 k Da。[结论]PBPX基因成功克隆到表达载体内并获得了表达。