金黄色葡萄球菌小菌落突变体诱导筛选及特性研究

稳定型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)小菌落突变体(small colony variants,SCVs)的获得,为抗SCVs药物的研究提供了重要的生物学材料。以S.aureus ATCC43300为出发菌株,利用低质量浓度(1.25~5.00µg·mL^(-1))庆大霉素二次诱导技术获得稳定型SCVs,并对其特性进行分析。结果表明,1/2×最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及2×MIC庆大霉素分别诱导6和12 h,可获得稳定型SCVs。SCVs生长缓慢,培养24 h可见较小菌落,培养7 h至生长对数期;对庆大霉素敏感性及产生物膜能力分别提高3和1倍;传代20次后恢复突变率为0%,抗逆性、药物敏感性、抗凝血性均增强,SigB调控系统及生物膜相关基因呈上调趋势,Agr调控系统及毒力因子下调。该方法的成功建立为SCVs的获得提出新的筛选策略,并为开展SCVs致病机理研究及新型抗SCVs药物研发提供稳定型受试菌株。

金黄色葡萄球菌小菌落变异体在关节假体周围感染中的分子病原学特征

本研究旨在了解关节假体周围感染(periprosthetic joint infection,PJI)中金黄色葡萄球菌小菌落变异体(Staphylococcus aureus small colony variant,SASCV)的毒力、耐药基因携带情况及分子型别,为探讨其致病机制提供基础数据。收集从19例PJI患者关节液中分离出的SASCV,进行全基因组测序、生物信息学分析及数据库比对,以了解其毒力相关基因和耐药基因的携带情况;采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)分析菌株型别,并构建系统发育树。结果显示,19株SASCV中,有8株与正常形态金黄色葡萄球菌混合生长。对全部27株菌株进行全基因组测序,基因组长度为2696437~3011803 bp,G+C含量为(32.8±0.05)%。共检出23种毒力相关基因:其中14种黏附素相关基因的检出率较高,为21.1%~100.0%;4种与免疫逃逸相关基因的检出率为36.8%~68.4%;5种溶血及杀白细胞素基因也有检出。耐药基因检出12种:blaZ检出率为78.9%(15/19);mecA检出率为31.6%(6/19);大环内酯类及氨基糖苷类抗生素耐药基因也有不同比例的检出。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中耐药基因的检出数量高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。MLST分析结果显示,19株SASCV共分10个型别。8组表型混合生长的菌株中,2组SCV与正常表型菌株分属不同型别,且毒力及耐药基因差异较大,其余6组为同一型别。本研究还发现,PJI中SASCV的生物膜相关黏附素基因检出率高,耐药基因中mecA检出率较高,MLST以ST59最多,其次为ST398和ST25。SCV与正常表型菌株混合生长时可分属不同型别。

金黄色葡萄球菌在人工关节感染中的分子型别与耐药基因特征

目的探讨导致人工关节假体周围感染(PJI)的金黄色葡萄球菌的抗菌药物耐药率、耐药基因和分子型别,为抗感染治疗提供依据和流行病学信息。方法收集2017年1月至2022年1月该院80例髋膝PJI患者关节液及假体周围组织中分离的金黄色葡萄球菌,进行抗菌药敏试验,分析其对骨科常用抗菌药物的耐药率;对菌株进行全基因组测序和生物信息学分析,研究其耐药基因携带情况;采用多点位序列分型(MLST)进行菌株分型和系统发育分析,比较主要流行分子型别对抗菌药物的耐药差异。结果该研究共收集80株金黄色葡萄球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检出率为26.25%,甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)检出率为73.75%。耐药性分析结果显示,MRSA对红霉素、克林霉素、氟喹诺酮类药物和四环素的耐药率较高,未发现对万古霉素、利奈唑胺和替加环素耐药菌株。95%的金黄色葡萄球菌携带耐药基因,其中β-内酰胺类耐药基因检出率最高(92.50%)。MRSA平均携带4.3种耐药基因,MSSA平均携带2.2种。金黄色葡萄球菌小菌落变异体(SCVs)检出率为23.75%。MLST结果显示,PJI中金黄色葡萄球菌主要流行克隆复合物型别为ST-398型(22.50%)、ST-5型(13.75%)和ST-59型(11.25%)。ST-59型金黄色葡萄球菌的万古霉素最低抑菌浓度相对较高。结论万古霉素、利奈唑胺可作为PJI中抗MRSA感染的主要选择;PJI中金黄色葡萄球菌SCVs检出率较高;ST-398、ST-5、ST-59型是该院PJI金黄色葡萄球菌的主要流行克隆菌株,应针对不同金黄色葡萄球菌克隆类型采取个性化抗感染治疗策略。

甲氧西林耐药的CO_2依赖型金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离和鉴定

目的对由临床分离的一株拟是金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCVs)进行鉴定、药敏试验和补偿试验,为预防和控制SCVs感染提供依据。方法从患儿脑瘤切除部位分泌的脓液中分离培养出一株金黄色葡萄球菌,进行菌落形态观察及生化鉴定、药敏试验、金黄色葡萄球菌种特异性基因(nuc)和甲氧西林耐药相关基因(mecA)的测序以及补偿试验。结果该菌株通过Vitek-2 Compact系统鉴定为金黄色葡萄球菌,该菌含有金黄色葡萄球菌菌种特异性基因nuc和甲氧西林耐药相关基因mecA。菌落形态主要表现为菌落细小、生长缓慢、溶血圈不明显(24 h);凝固酶活性下降;触酶阳性;革兰染色为革兰阳性球菌,呈葡萄状排列;对β-内酰胺类抗生素有抗药性;补偿试验鉴定该SCVs为CO2依赖型。结论成功分离鉴定出一株甲氧西林耐药的CO2依赖型金黄色葡萄球菌SCVs,为开展金黄色葡萄球菌SCVs相关疾病的预防和控制及其相关致病机制研究奠定基础。

金黄色葡萄球菌小菌落突变株感染小鼠乳房炎模型的建立

为了建立由金黄色葡萄球菌小菌落突变株（small colony variants，SCVs）诱发感染乳房炎动物模型，本试验取40只分娩6-8d的BALB／c小鼠，随机分成8组（n=5），分别为阴性对照、生理盐水组和不同剂量金黄色葡萄球菌SCVs及金黄色葡萄球菌质控菌株（1．0×10^3、1．0×10^4、1．0×10^5CFU／mL）试验组，对生理盐水组及各试验组小鼠第4对乳腺注射生理盐水和对应剂量的菌液（50mL／只），注射后24h解剖观察病理变化，一侧乳头制作石蜡切片，另一侧研磨后用ELISA检测试剂盒检测组织匀浆上清中的TNF-α含量。结果显示，注射菌液的试验组，小鼠均出现不同程度的临床症状，乳腺出现不同程度的炎性症状和病理变化。同一注射剂量下，金黄色葡萄球菌质控菌株较金黄色葡萄球菌SCVs病理变化严重，通过SPSS等软件对试验数据进行统计分析后得出，高浓度处理组金黄色葡萄球菌质控菌株的TNF-α表达量极显著高于金黄色葡萄球菌SCVs（P〈0．01）。结果表明，金黄色葡萄球菌及其SCVs均可用来建立小鼠乳房炎模型，且金黄色葡萄球菌SCVs引起的情况较其正常株轻微，这一结果为由金黄色葡萄球菌SCVs引起的奶牛慢性乳房炎的预防和控制及其致病机制的研究提供了新的材料和有益的探索，为SCVs与慢性乳房炎更深层次关系的研究奠定基础。

小鼠细菌性乳腺炎模型研究进展

奶牛细菌性乳腺炎一直是困扰奶牛养殖业的一大难题,给奶牛养殖行业造成巨大经济损失,直接危害奶牛健康。为有效治疗奶牛细菌性乳腺炎,研究人员需要通过动物模型来进行相关研究,以期找到优良的治疗方法。随着动物模型多年的探索与使用,小鼠细菌性乳腺炎模型因具有省时、省力以及性价比高的优点获得了研究人员的广泛认可,被大量用于相关研究中。就此对小鼠细菌性乳腺炎模型的建立、特点以及应用进行综述,旨在为细菌性乳腺炎相关研究提供参考。

成骨细胞吞噬内化金黄色葡萄球菌在骨髓炎发病机制中的作用

成骨细胞与破骨细胞存在于骨组织中,负责骨细胞外基质的形成与吸收,共同维持骨代谢的平衡。近年研究发现,这些骨组织中的细胞与免疫细胞通过多种通路存在相互作用,从而衍生出了一门新学科——"骨免疫学",其目的在于研究骨骼系统与免疫系统之间相互作用的分子机制。其中成骨细胞发挥了重要作用。金黄色葡萄球菌是骨髓炎中最常见的致病菌,可以粘附于成骨细胞表面并被内化,逃避宿主免疫系统的杀灭,并发生表型的转变(如小菌落变异等),而当细胞死亡后这些细菌被释放,再次感染其他细胞,形成新的感染,导致骨髓炎临床治疗效果较差且迁延不愈。对金黄色葡萄球菌侵袭成骨细胞这一过程进行深入的了解和研究将有助于开发治疗骨髓炎的新靶标。本文就成骨细胞吞噬内化金黄色葡萄球菌在骨髓炎发病中的作用做一综述。

金黄色葡萄球菌小菌落突变株体外感染乳腺上皮细胞的研究

为研究金黄色葡萄球菌小菌落突变株(S.aureus small colony variants,SASCVs)与正常株对原代培养的乳腺上皮细胞的侵袭情况,并观察对比其对细胞结构的损坏程度和对乳腺上皮细胞的影响,本试验对由云南农业大学动物医学实验教学中心实验室分离的一株SASCV进行体外感染小鼠乳腺上皮细胞试验,将分离出的一株SASCV及质控菌株ATCC 25923分别注入实验室体外培养的小鼠乳腺上皮细胞内,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察质控菌株ATCC 25923及SASCVs诱导乳腺上皮细胞凋亡的细胞形态学变化;用流式细胞仪(Annexin VFITC/PI双染法)定量检测质控菌株ATCC 25923及SASCVs感染乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用,观察细胞的变化。结果显示,质控菌株ATCC 25923及SASCVs感染小鼠乳腺上皮细胞3h后,可诱导乳腺上皮细胞发生凋亡,显示为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型的凋亡特征。Annexin V-FITC/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,并且阳性对照组的细胞凋亡率明显高于试验组。结果表明,SASCVs在侵染细胞的过程中达到一定数量不再上升;SASCVs的凋亡率明显的较正常金黄色葡萄球菌低。因此,SASCVs也可诱导乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征。本试验结果为以后预防和控制SASCVs感染奶牛慢性乳房炎提供试验依据。

低温对不同抗性金黄色葡萄球菌细胞膜完整性及相关基因表达的影响

为研究不同金黄色葡萄球菌对低温(4℃)的耐受性差异,及其与细胞膜完整性及相关基因表达调节之间的关系,首先通过涂布平板计数法对4株金黄色葡萄球菌食品分离菌株的低温抗性进行比较,发现经过4周的低温胁迫后,与其他菌株相比,BB-1菌株可形成小菌落变种(small colony variants,SCVs),且低温耐受能力最强,存活率达75.50%。而低温耐受能力最弱,且不能形成小菌落变种的BH-25菌株存活率仅为45.68%。随后通过测定胞内容物泄露量、菌悬液电导率和结晶紫染色分析,研究低温对不同金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响,发现BB-1细胞膜的完整性在低温胁迫下强于BH-25。采用实时荧光定量PCR分析金黄色葡萄球菌胁迫耐受的主要基因(rsbV、rsbW和sigB)和细胞膜脂肪酸合成的主要编码基因(fabD、fabF、fabG、fabH和fabI)表达量的变化,发现BB-1的抗性调控基因和细胞膜脂肪酸调控基因表达水平显著高于BH-25(P<0.05)。可形成SCVs细胞的BB-1菌株在低温下存活能力更强,并且细胞膜更完整,细胞内容物泄露量最少,而且在低温环境下rsbV-rsbW/sigB调节系统基因和调控细胞膜脂肪酸fab家族基因的转录表达水平均显著高于不能形成SCVs细胞的其他菌株(P<0.05)。该研究对深入分析金黄色葡萄球菌的低温抗性机制,以及确立冷链食品安全控制技术具有一定的理论指导意义。

槲皮素-替米考星混合物纳米粒的制备及对金黄色葡萄球菌小菌落变异株抗菌活性研究

【目的】制备一种适用于治疗由金黄色葡萄球菌小菌落变异株(Staphylococcus aureus small colony variants,SASCVs)引起奶牛乳腺炎感染的槲皮素-替米考星混合物纳米粒,评价其对SASCVs菌株的抗菌活性。【方法】通过对槲皮素(0.05、0.10、0.15和0.20 g)和替米考星原料药用量(0.2、0.3、0.4和0.5 g)及转速(500、1000、1500 r/min)、反应时间(0.5、1.0、2.0 h)、反应温度(25、50、75℃)、溶剂浓度(5.0%、7.5%、10.0%)进行考察,以外观性状为指标,筛选槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优配方和制备条件;以微观形态、沉降体积比、再分散性、粒径和Zeta电位为指标,对制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒表征;通过琼脂扩散法、微量肉汤稀释法和体外杀菌曲线,对比槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的抗菌活性,评价槲皮素-替米考星混合物纳米粒的优势。【结果】当替米考星为0.4 g、槲皮素为0.1 g、溶剂为20 mL 7.5%的聚乙二醇溶液,在转速为1000 r/min、反应时间为1 h、反应温度为50℃时,所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒最优,其溶液外观性状显示颜色清亮,无沉淀和絮状物;微观形态显示该混合物纳米粒分布均匀,颗粒大小一致;沉降体积比为1,再分散性良好,平均粒径为741.9 nm,Zeta电位为-7.69 mV。替米考星标准品、槲皮素-替米考星混合物纳米粒和市售替米考星溶液对SASCVs菌株的抑菌圈直径分别为2.54、1.51和1.38 cm,对SASCVs菌株的最低抑菌浓度分别为1、1和2μg/mL;体外杀菌曲线表明,槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株表现出明显的浓度依赖性。【结论】本研究所制备的槲皮素-替米考星混合物纳米粒对SASCVs菌株具有较强杀菌能力,可为治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供基础研究资料。

纳米抗菌药物抗金黄色葡萄球菌感染研究进展

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus耐药性问题日益严重,由其引起的奶牛乳腺炎的临床治疗面临着严峻的挑战。通过新型纳米载体系统所制备的纳米抗菌药物治疗金葡菌感染尤为重要。通过总结金葡菌感染机制、常规药物及纳米抗菌药物在治疗金葡菌感染中的应用,讨论并分析纳米抗菌药物在兽医临床上治疗金葡菌感染所面临的挑战,对纳米抗菌药物治疗金葡菌感染的应用前景进行展望。

一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定

【目的】由于金黄色葡萄球菌(金葡菌)小菌落突变株(small colony variants,简称SCVs)可引起持续复发性感染,且对氨基糖苷类有抗药性,在临床诊断和治疗上造成很大的困扰。我国国内尚无金葡菌SCVs的报道,本研究旨在分离鉴定出金葡菌SCVs菌株,为国内进行SCVs的相关研究提供生物学材料。【方法】通过细菌的形态鉴定、种特异性基因(nuc)的PCR扩增鉴定以及系列生化实验,从人源、动物源及环境源共104株金葡菌分离株中筛选得到金葡菌SCVs,并通过甲萘醌、硫胺素、胸腺嘧啶和血红素等补偿实验加以验证。【结果】获得一株来自环境源的金葡菌SCVs分离株,命名为CDC54,该菌株含有金葡菌种特异性基因nuc,主要表现为菌落细小,色素形成减少,凝固酶活性下降,对甘露醇的发酵作用减弱,溶血活性降低及对氨基糖苷类抗生素有抗药性。【结论】成功分离鉴定出一株金葡菌SCVs,为国内开展SCVs相关疾病的防控和进一步研究SCVs的相关致病机理奠定基础。

金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离与鉴定

目的对临床来源的两株疑似金黄色葡萄球菌小菌落突变株(SCVs)进行鉴定及表型特征研究,为SCVs感染的诊断和治疗提供依据。方法从临床患者的标本中分离培养出两株疑似金黄色葡萄球菌,通过观察细菌生长特性、药敏试验、生化鉴定、金黄色葡萄球菌特异基因(nuc)的实时荧光PCR扩增鉴定以及化学限定培养基补偿试验研究其特征。结果将两株金黄色葡萄球菌SCVs分离株命名为SA-1和SA-2,两株菌株均含有金黄色葡萄球菌特异基因(nuc),SA-2被VITEK-2Compact系统鉴定为金黄色葡萄球菌,SA-1却无法被鉴定;与野生株相比较,两株菌均生长缓慢、菌落细小、溶血环不明显、凝固酶活性下降、补偿试验鉴定两株菌在营养琼脂平板生长接近野生株,SA-1对胸腺嘧啶有依赖性;SA-2对血红素有依赖性。结论成功分离鉴定出两株临床来源的金黄色葡萄球菌SCVs,为进一步研究金黄色葡萄球菌SCVs的致病机制及相关疾病的诊断、治疗奠定了基础。

金黄色葡萄球菌小菌落突变株体外感染奶牛乳腺上皮细胞的研究

为了研究金黄色葡萄球菌小菌落突变株对正常奶牛乳腺上皮细胞的侵袭作用,试验采用普通光学和扫描电子显微镜观察的方法对临床分离的一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株及金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC25923体外感染培养的奶牛乳腺上皮细胞引起的细胞形态变化及细菌侵入细胞的过程进行了研究。结果表明:金黄色葡萄球菌分离菌株与质控菌株ATCC25923在体外感染乳腺上皮细胞3 h后出现凋亡现象,表现为细胞体积缩小,核质浓缩,核膜核仁破碎,胞膜有小泡状形成。说明金黄色葡萄球菌小菌落突变株对奶牛乳腺上皮细胞具有致病性,但致病力远低于金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC25923,金黄色葡萄球菌小菌落突变株可以在奶牛乳腺上皮细胞中持续存在,在细胞中有一定存活,与金黄色葡萄菌株质控菌株ATCC25923相比对细胞的侵袭能力较低。

MALDI-TOFMS鉴定一株小菌落变异型金黄色葡萄球菌

目的探讨运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术对金黄色葡萄球菌小菌落变异型的特征性蛋白指纹图谱进行深度研究的价值。方法分别采用传统生化鉴定、16S r RNA测序技术和MALDI-TOF MS技术对1株小菌落变异型金黄色葡萄球菌进行鉴定,通过质谱鉴定系统VITEK MS的质谱科研模式获取金黄色葡萄球菌小菌落突变株(small colony variants,SCV)的质谱图,分析代表金黄色葡萄球菌agr和sig B系统的m/z表达强度,并用SARAMIS软件构建基于质谱峰谱特征的系统发育树。结果使用MALDI-TOF MS技术鉴定该菌株为金黄色葡萄球菌,与传统生化鉴定、16S rRNA测序技术的鉴定结果一致。其菌落形态符合典型SCV菌株的特征,预示生物膜形成的PSMα3(m/z 2634.4)、PSMα1(m/z 2286.8)和PSMα4(m/z 2198.6)的表达强度分别为100%、76.1%和32.3%,反映急性早期感染状态的agr调控系统的delta毒素强度只有10%;反映慢性、复发性感染的sigB调控系统的峰谱相对强度均<25%,该菌株和科研菌种库SCV的系统发育树近似度>70%。结论 MALDI-TOF MS技术不仅能够快速准确鉴定不典型金黄色葡萄球菌,且生成的质谱图能够初步提示菌株在宿主体内的感染状态,表明该技术具有极大的应用前景。

硫酸头孢喹肟纳米凝胶的制备及疗效初步评价

制备一种适用于治疗金黄色葡萄球菌小菌落变异株(Staphylococcus aureus small colony variants,SASCVs)感染的硫酸头孢喹肟纳米凝胶。在离子交联剂作用下,通过凝胶材料之间静电作用自组装形成硫酸头孢喹肟纳米凝胶,以外观性状、微观形态、沉降体积比、再分散性、粒径、Zeta电位为指标筛选最优配方后,对比硫酸头孢喹肟纳米凝胶与其商品化注射液治疗SASCVs感染小鼠模型的结果,对硫酸头孢喹肟纳米凝胶进行评价。结果显示,当三聚磷酸钠、明胶和海藻酸钠的质量浓度分别为0.25,25,15 g/L时为最优配方。最优硫酸头孢喹肟纳米凝胶外观性状显示无沉淀和絮状物,颜色清亮;微观形态显示药物被明胶和海藻酸钠所形成的网络结构所包裹;沉降体积比为1;再分散性良好;包封率(EE)和载药量(LC)分别为(71.2±1.32)%,(16.3±0.45)%;平均粒径为(23.01±1.14)nm;Zeta电位为(-25.4±0.91)mV。硫酸头孢喹肟纳米凝胶和其商品化注射液的治愈率分别为90.0%,86.7%,表明硫酸头孢喹肟纳米凝胶治疗SASCVs感染小鼠的效果略优于硫酸头孢喹肟注射液。本研究将为治疗由SASCVs菌株引起的奶牛乳腺炎提供依据。