超抗原SEB和D-氨基半乳糖对小鼠肝细胞的作用观察

用超抗原葡萄球菌Ｂ型肠毒素（ＳＥＢ）、Ｄ－氨基半乳糖（Ｄ－ＧａｌＮ）及两者合用腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，于２、６、１２、２４ｈ取肝脏和血标本，从形态学和生化指标来研究肝细胞的死亡模式；同时还检测了小鼠２４ｈ死亡率。结果发现单用ＳＥＢ可诱导肝细胞凋亡，其机制可能与ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ等细胞因子的产生和作用有关。单用Ｄ－ＧａｌＮ可同时引起肝细胞凋亡和变性，ＳＥＢ和Ｄ－ＧａｌＮ合用２、６ｈ见肝细胞凋亡，１２ｈ后以肝细胞坏死为主，小鼠２４ｈ死亡率达５０％。因而，推测凋亡与坏死间存在一定的联系。

超抗原SEB诱导外周血单核细胞杀伤肿瘤效果

目的通过观察葡萄球菌肠毒素B(SEB)对外周血单核细胞(PBMC)杀瘤活性的影响,寻找适用于肿瘤过继免疫治疗的新途径。方法密度梯度离心法分离富集PBMC,分别用10-12,10-11,10-10,10-9g/L浓度的SEB作用于PBMC,12,24,36,48 h后测定PBMC对K562细胞的杀伤活性。结果SEB处理PBMC 12 h后杀瘤活性增强,至24 h杀瘤活性最佳;在一定浓度范围内PBMC的杀瘤活性随SEB浓度的升高而增强。结论超抗原SEB在体外能够增强PBMC的杀瘤活性。

Tf-SEB偶合蛋白对荷瘤小鼠的疗效及其机理探讨

目的 研究人转铁蛋白（Ｔｆ）与金黄色葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）偶联后，在体内对肿瘤的治疗效果及其机理。方法 采用化学方法将Ｔｆ与ＳＥＢ偶联成Ｔｆ－ＳＥＢ偶联蛋白，观察该偶联蛋白对荷瘤小鼠的疗效；采用免疫细胞化学方法初步探讨该偶联蛋白在体内的抗肿瘤机理。结果 偶联蛋白处理组动物的肿瘤发生率和死亡率及肿瘤体积均显著低于单体ＳＥＢ处理组和其它各组；免疫细胞化学结果显示，偶联蛋白处理的动物肿瘤组织内有更为明显的ＣＤ４~＋Ｔ细胞和ＣＤ８~＋Ｔ细胞浸润。结论 经化学偶联的Ｔｆ－ＳＥＢ偶联蛋白在体内比单体ＳＥＢ具有更强的激活Ｔ细胞的抗肿瘤作用，该作用可能部分是由于具有导向效应的超抗原Ｔｆ－ＳＥＢ偶联蛋白诱导了超抗原依赖细胞介导的细胞毒效应所致。

金葡菌野生株SEB基因的亚克隆及其原核表达

目的亚克隆金葡菌野生株S407030肠毒素B(SEB)基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中表达,以获得重组SEB(rSEB)蛋白。方法将含有SEB基因的质粒pMD-18T/SEB双酶切获得目的片段,插入表达载体pGEX-4T-2中构建重组子pGEX-4T-2/SEB,并转化E.coliJM109感受态菌,阳性克隆以双酶切和PCR法鉴定;含重组质粒的工程菌以IPTG诱导表达rSEB蛋白;表达产物进行SDS-PAGE分析,并采用B-PER GST融合蛋白试剂盒纯化重组rSEB,West-ern blot鉴定其免疫反应性。结果重组质粒经双酶切和PCR扩增鉴定均获得约705 bp的基因片段,与预期结果相一致;诱导表达的含GST的融合重组rSEB蛋白分子质量单位约为53 ku,纯化后作SDS-PAGE电泳显示一条蛋白带,Western blot显示rSEB能够被兔抗SEB抗体识别。结论金葡菌野生株SEB在大肠埃希氏菌中得到有效表达,并获得电泳级纯度的重组rSEB,重组蛋白具有一定的免疫活性,为进一步研究其生物毒性与开发诊断试剂提供了生物材料。

Slit2在OVA/+SEB小鼠特应性皮炎模型炎性浸润、血管新生中的作用

目的探讨分泌型糖蛋白Slit2在卵清蛋白(OVA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)致敏小鼠特应性皮炎模型(AD模型+sponge模型)的皮肤炎性浸润、血管新生中的作用。方法1 g/L卵清蛋白(OVA)3周期贴片法重复刺激Balb/c小鼠背部皮肤构建小鼠AD模型,期间分别用0.5/5μg SEB处理该模型小鼠,35 d后评估皮炎程度,ELISA检测IgE水平。评估模型情况后,选皮炎程度最重的OVA+5μg SEB组给予重组Slit2蛋白处理。HE染色计数各组真皮细胞内炎症细胞数、表皮厚度,Western blot检测各组Slit2蛋白表达量,ELISA检测各组皮肤IL-13、INF-γ表达量;构建小鼠Sponge海绵模型观察各组血管新生情况,免疫组化检测各组海绵内Slit2^(+)细胞数,以及CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞的浸润情况。结果小鼠AD模型中OVA+5μg SEB组皮炎程度最重,炎性细胞浸润最多,表皮炎性增生最厚,IgE、IL-13、IFN-γ水平明显升高,Slit2蛋白表达量最高;给予重组Slit2蛋白处理后皮炎程度、炎细胞浸润、表皮厚度均减少,IL-13、IFN-γ水平降低,但IgE水平无统计学差异。小鼠Sponge模型中,OVA+5μg SEB组血管新生、Slit2^(+)细胞数最多,CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞浸润最多;给予Slit2蛋白处理后血管新生、Slit2^(+)细胞数明显减少,CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞浸润减少。结论在AD病程中,Slit2蛋白有一定的抗炎作用,可减少淋巴细胞浸润,且Slit2同时具有抗血管生成和促血管生成的作用。

金黄色葡萄球菌B型肠毒素的培养产毒与柱层析纯化

本文采用玻璃纸覆盖琼脂平板法,在37℃培养金黄色葡萄球菌48h后,收集菌体,10000×g离心15min,上清液经聚乙二醇20000浓缩。浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32层析和葡聚糖凝胶SephadexG-75过滤纯化,获得电泳纯的金黄色葡萄球菌B型肠毒素。实验证明,利用该简化的二步柱层析分离得到的金黄色葡萄球菌B型肠毒素完全能满足血清学检实验和鉴定的要求,方法简便易行,一般实验室均可使用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究

目的 :探讨金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )L型肠毒素B的产生量及其基因存在情况。方法 :将金葡菌诱导成稳定L型后 ,用ELISA法检测葡萄球菌肠毒素B(SEB) ,用PCR法检测SEB基因。结果 :金葡菌L型SEB的产生量与原菌比差别无显著性 (P >0 .0 5 ) ,PCR发现 4 78bp的阳性条带。结论 :金葡菌变异为L型后SEB产生量不变 ,其基因也未丢失。

产B型肠毒素金黄色葡萄球菌及其L型某些致病物质的比较

目的 :比较产B型肠毒素金黄色葡萄球菌 (金葡菌 )及其L型的某些致病物质。方法 :检测金葡菌L型产生血浆凝固酶、耐热核酸酶及肠毒素B的情况 ,并与原菌进行比较。结果 :金葡菌L型使血浆延迟至 2 4h发生凝固 ,耐热核酸酶的透明环减小 ,肠毒素B的光密度 (OD)值未见明显减少。结论 :金葡菌L型仍能产生致病物质 。

金黄葡萄球菌野生株肠毒素B重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中表达金黄葡萄球菌野生株肠毒素B(SEB)重组蛋白,并进行纯化。方法采用PCR方法从金黄葡萄球菌基因组中扩增出SEB基因片段,与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T/SEB,测序分析后,亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,转化感受态E.coliJM109,IPTG诱导表达。表达产物采用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit纯化后进行Western blot鉴定。结果SEB基因扩增片段大小为705bp,测序结果显示与金黄葡萄球菌S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%,存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364、699、899和988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser和Met→Leu);表达的含GST的融合蛋白相对分子质量约53000,纯化后经SDS-PAGE分析,可见单一条带。Western blot显示表达产物可被兔抗SEB抗体所识别。结论已成功表达并纯化了金黄葡萄球菌野生株SEB重组蛋白,为开发SEB免疫诊断试剂提供了材料。

离子液体保护聚苯胺纳米金复合膜传感器的制备及其在检测乳制品中金黄色葡萄球菌毒素B的应用

采用原位合成法制得聚苯胺修饰纳米金的复合膜,并采用紫外、红外及透射电镜对其进行表征,以离子液体1,3-二丁基-咪唑六氟磷酸盐为保护复合膜的溶剂,成功制得离子液体保护的聚苯胺纳米金复合膜免疫传感器,并应用于乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的检测。在Fe(CN)63-/4-溶液中,采用循环伏安法(CV)及交流阻抗法(EIS)对传感器进行表征与测定,建立了SEB检测标准曲线,Y=933.46x+1399.8,线性范围为0.1～8.0μg/L,相关系数R2=0.9932,检出限明显降低(0.033μg/L,S/N=3)。结果表明,本传感器特异性良好,乳品检测回收率在88%～119%之间,稳定性好,可应用于乳品中的SEB快速检测。

人转铁蛋白—葡萄球菌肠毒素B偶联蛋白的抗肿瘤活性

目的研究人转铁蛋白（HuTf）与金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）偶联后，其Tf－SEB偶合蛋白的抗肿瘤活性，探讨Tf作为载体用于肿瘤导向免疫治疗的可能性。方法利用凋亡细胞指数检测和超抗原依赖的细胞介导的细胞毒（SDCC）效应，观察该偶合蛋白的起抗原活性和激活T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。结果Tf－SEB偶合蛋白比单体SEB能更有效地激活T细胞的杀伤肿瘤细胞活性，并对MHC－Ⅱ类分子阴性的肿瘤靶细胞也具有较强的杀伤效果。结论Tf作为载体应用于肿瘤的导向治疗具有可行性。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的分离纯化

为了分离纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB),在离心、浓缩后,将浓缩液依次经羧甲基阳离子交换纤维素CM-32和葡聚糖凝胶G-75两步柱层析,再经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,获得了电泳纯的金黄色葡萄球菌肠毒素B。实验证明,该简化的二步柱层析分离得到的SEB纯度高,方法简便易行,一般实验室均可采用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对体外培养小鼠胚胎发育的影响

目的了解金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对胚胎发育的影响。方法采用植入后全胚胎培养技术,将8.5d小鼠胚胎与终浓度分别为0.1、1及10μg/ml的SEB共培养48h后,观察SEB对胚胎生长发育和器官形态分化影响。结果SEB可影响体外小鼠胚胎的发育。0.1μg/mlSEB首先影响卵黄囊直径,当SEB为1及10μg/ml时,胚胎生长发育指标和器官形态分化评分均明显低于对照组,并出现小头、脑膨出、前后神经管未闭、体位异常、鳃弓及前肢发育迟缓、大心包及心包积液等畸形。结论SEB能明显影响体外小鼠胚胎发育,可能是金葡菌L型导致体外胚胎发育畸形的主要机制之一。

葡萄球菌肠毒素B对特应性皮炎患者外周血单个核细胞分泌IL-17的影响

目的:评价葡萄球菌肠毒素B(SEB)对特应性皮炎(atopkdermatitis,AD)患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-17的影响。方法:从11例AD患者和8名对照者的外周血中分离PBMC,用CD28单抗和SEB刺激96 h后,ELISA法检测IL-17水平。放免法检测患者血清总IgE。结果:SEB对AD患者和健康人PBMC产生IL-17均有显著促进作用(P<0.01),SEB的促进作用强于CD28单抗(P<0.05)。IL-17水平与血清总IgE无相关性。结论:IL-17可能在AD的发病中起一定作用。

超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导小鼠免疫细胞凋亡

为探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素Ｂ（ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ，ＳＥＢ）对小鼠免疫细胞凋亡的影响，采用形态学观察及ＤＮＡ断裂指标检测了ＳＥＢ诱导小鼠免疫细胞凋亡的剂量和效应关系。结果表明，１２．５μｇ、２５μｇ和５０μｇＳＥＢ均可引起部分胸腺细胞、脾细胞和肠系膜淋巴结细胞出现核固缩、核断裂及凋亡小体形成等形态学变化。上述免疫细胞ＤＮＡ琼脂糖电泳可见典型的“梯状”带。而对照组免疫细胞未见上述明显变化。本实验结果表明超抗原ＳＥＢ可诱导小鼠免疫细胞凋亡。

金黄色葡萄球菌肠毒素B功能表位及中和抗体研究进展

金黄色葡萄球菌(金葡菌)肠毒素B(SEB),是造成食物中毒乃至中毒性休克综合征的主要病因。SEB也是一种超级抗原,可以刺激T细胞,能够同时与抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合物Ⅱ类分子和T细胞受体上的Vβ结合。随着SEB的结构逐步得到解析,揭示了SEB结构与功能的关键表位。临床上尚无针对SEB中毒的有效疫苗和药物。SEB中和抗体因其高特异性和低毒副作用,成为研究者们的研究首选和重点,从鼠源抗体、人鼠嵌合抗体到人源抗体等均有报道。本文对SEB功能表位及其中和抗体的研究进展进行综述。

体外联合抗原修饰的树突状细胞的抗癌效应

目的:研究结肠癌患者外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)体外联合抗原诱导后的免疫活性.方法:从结肠癌患者外周血中分离并培养DC,时效实验中分时段以肿瘤抗原修饰DC,取最佳组与T淋巴细胞共孵不同时间,用MTT检验其对肿瘤细胞的杀伤率;量效实验中将肿瘤抗原和不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B(staph-lococcus aureus enterotoxin B,SEB)在上一步得出的最佳时间内修饰DC,取最佳组按不同比例(DC:T淋巴细胞)来共孵上一步得出的最佳共孵时间,用MTT检验其对肿瘤细胞的杀伤率.结果:时效实验组抗原修饰36 h组DC特有分子表达最高,对结肠腺癌细胞的杀伤率也最高,与其他组比较有差异(35.92±0.71 vs 14.85±1.24.35.92±0.71 vs 9.68±1.25.35.92±0.71 vs 17.97±1.01.35.92±0.71 vs 20.32±0.92,P<0.05),量效实验组联合抗原修饰第7天(SEB:100μg/L)DC表达DC特有分子最高,在联合修饰组内,以1:100组的杀伤率最高,与其他组比较有显著差异(47.70±2.84 vs 28.99±6.95.47.70±2.84 vs 40.02±3.65.47.70±2.84 vs 34.55±3.21,P<0.01).结论:体外DC抗原修饰和递呈的最佳时间都是36 h,联合应用超抗原SEB的最佳值100 ug/ L.DC与T淋巴细胞的最佳共孵比例是1:100.

金黄色葡萄球菌SEB基因的克隆及其系统发生分析

目的克隆和测定金黄色葡萄球菌深圳分离株S4070肠毒素B(SEB)基因序列,并作系统发生分析。方法采用PCR法从金黄色葡萄球菌S4070基因组中扩增出SEB基因片段,纯化后与pMD-18T载体连接构建重组子pMD-18T-SEB,并转化E.coli DH5α;阳性克隆质粒经双酶切法鉴定后,采用双脱氧末端终止法作序列测定,并以BLAST和MEGA4软件分析其分子特征。结果从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出约704bp的基因片段,阳性克隆质粒鉴定结果与预期一致;序列测定结果显示,所克隆的SEB基因片段含704个碱基,与GenBank中17株金黄色葡萄球菌SEB基因序列比对,无碱基的插入或缺失,同源性均为98%以上;基于SEB基因序列,采用邻位连接法(Neigh bor-joining)构建系统发生树,深圳S4070株与日本分离株NN35、NN37、NN41-F1D、NN41-F1F和NN41-F1G以及印度分离株DQ535901、DQ535902的遗传距离小,同处在一个分支群上。结论实验成功克隆了金葡菌深圳株S4070 SEB基因,不同分离株间SEB基因序列相对保守,本分离株与日本和印度分离株遗传关系较近。