食品中金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的研究

以耐热核酸酶基因nuc、纤维蛋白原结合蛋白基因clfA和SmaI限制性酶切片段特异序列为靶基因,设计筛选引物,建立并优化了检测金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus,SA)的多重PCR体系。采用10株SA和46株非SA验证了该多重PCR具有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到1.197 3 ng。人工污染样品,当起始污染量为1.2个/g时,37℃增菌培养6 h即可检出。一共检测了43份样品,检出3份阳性样品,其中有2份阳性样品与传统方法一致,另外一份阳性样品用测序验证。作者建立的多重PCR方法可特异、快速地实现对SA的检测。

多重PCR检测食源金黄色葡萄球菌nuc、blaZ和mecA基因方法的建立与应用

目的建立快速检测食源金黄色葡萄球菌(Sa)耐热核酸酶基因(nuc)、β-内酰胺酶基因(blaZ)和甲氧西林耐药基因(mecA)的多重PCR方法。方法根据GenBankSa的nuc、blaZ和mecA基因序列,设计3对特异性引物,建立鉴定Sa及分析Sa耐β-内酰胺类抗生素三重PCR方法 ,并对79株食源Sa进行基因检测与表型比较。结果显示供试Sa中检出nuc、blaZ基因阳性率分别为97.47%、73.42%,mecA基因检出为阴性;nuc基因检出与其表型符合率达97.47%;而blaZ扩增结果与β-内酰胺酶试验、青霉素类敏感试验同时符合率为49.37%,前者与后两者符合率分别为60.76%和75.95%;mecA与耐甲氧西林表型符合率为100%;此次79株食源Sa中无耐甲氧西林Sa。结论该方法简便、快捷、准确,为食源Sa鉴定和耐药性分子分析提供了参考依据。

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。

多重PCR检测食源金黄色葡萄球菌毒素基因的建立及应用

建立了快速检测食源性金黄色葡萄球菌(SA)16SrDNA、纤维蛋白结合蛋白(clfa A和clfa B)、纤连蛋白结合蛋白(fnbp A和fnbp B)的多重PCR方法.利用GenBank SA的16SrDNA,clfa A,clfa B,fnbp A和fnbp B基因序列,设计5对特异性引物,建立鉴定SA及分析SA毒素基因的五重PCR方法,并对160株食源SA进行属鉴定和毒素基因检测.结果显示,供试的160株食源SA中葡萄球菌属16SrDNA鉴定均为阳性;4种SA毒素基因检出率由高到低依次为clfa A(91.88%),fnbp A(21.88%),clfa B(19.38%),fnbp B(8.13%).该方法简便、快捷、准确,为食源SA的属鉴定和毒素基因分析提供了快速检测方法,同时可作为食源性疾病事件处理的溯源技术.

同时检测四种病原菌的PCR方法研究

(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法。(方法)本研究针对大肠杆菌的(16 s-23 s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化。(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右。(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础。

食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

建立并优化食品接触材料中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌3种致病菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并模拟阳性样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到10~3 CFU/mL,为食品接触材料的微生物检测提供技术保障。

食品中三种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是食品中重要的致病菌,研究并建立其多重PCR的检测体系,对开发食源性致病菌快速检测试剂盒具有重要意义。根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)和蜡样芽胞杆菌的溶血素基因(hblA),设计合成3对特异性引物,进行单一PCR反应,分别验证其特异性。在此基础上建立同时检测3种食源性致病菌的多重PCR体系。结果显示,本研究采用热裂解法提取致病菌DNA模板条件下,建立的多重PCR检测方法检出限达到104CFU/mL,整个检测时间在6 h以内,具有简单、快速、灵敏度高的特点。该方法具有一定的实际推广价值,适合于在食品检测以及临床检验等领域。

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。

PCR检测速冻食品中金黄色葡萄球菌与沙门菌

目的探讨多重PCR法在速冻食品中金黄色葡萄球菌与沙门菌检测中的应用效果。方法应用金黄色葡萄球菌ATCC8095与沙门菌ATCC14028对速冻水饺进行人工染菌,分别取不同培养时间点增菌液采用水煮法、酚氯仿法与滤柱法剂盒法提取DNA,分析金黄色葡萄球菌与沙门菌多重PCR法在速冻食品中的检测灵敏度、检出时限及合适的DNA提取方法。结果通过不同持续培养时间检测金黄色葡萄球菌与沙门菌基因组DNA,在持续培养时间超过4 h时应用多重PCR法便可检测出速冻食品中100 CFU/g起始菌落数目的金黄色葡萄球菌与沙门菌。水煮法的产量最高、所需时间最短并且费用最低,而试剂盒法提取纯度最高。结论应用多重PCR法检测速冻食品中黄金色葡萄球菌与沙门菌的效果较好,具备良好的快捷性、高效性及稳定性。

2006—2011年西安市食品及食物中毒中金黄色葡萄球菌毒素基因分布及分型研究

目的了解2006—2011年西安市污染食品及食物中毒中金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离株肠毒素(SEs)、杀白细胞素(PVL)、表皮剥落毒素(ETs)、毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)等毒素基因的分布状况,并比较两种分离株在基因分布及分型上的差异。方法采用多重PCR法检测61株S.aureus(包括40株食品分离株和21株食物中毒分离株)sea、seb、sec、sed、pvl、eta、etb、tsst-1基因,其中sea、seb、sec、sed基因引物加入同一反应体系,剩余4对基因引物加入另一反应体系。结果 40株食品分离株中17株检出毒素基因(42.50%);21株食物中毒分离株中18株检出毒素基因(85.71%),食物中毒分离株毒素基因的检出率明显高于食品分离株(P<0.01)。食品分离株中主要流行的毒素基因为sea(25%)、eta(12.5%),未检测到携带etb、tsst-1基因的菌株;同时得到8种毒素基因型,主要流行的基因型为sea(10.00%)、sea+eta(7.50%)。食物中毒分离株中主要流行的毒素基因为sea(76.19%)、sec(28.57%),未检测到携带pvl基因的菌株;同时得到6种毒素基因型,主要流行的基因型为sea(42.86%)、sea+sec+tsst-1(14.29%)。结论 S.aureus食品分离株和食物中毒分离株在毒素基因的分布及分型上存在较大差异。