stefins在肿瘤发生发展中作用的研究进展

stefins属于Ⅰ型半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员,具有多种生物学功能活性:调控细胞内外蛋白水解的平衡,参与蛋白质的分解代谢,调控细胞增殖与凋亡,在细胞分化、感染与免疫、血管生成及肿瘤细胞侵袭和转移等方面也发挥着重要的生理功能。近年来在对stefins参与肿瘤发生发展的作用的研究中发现stefins对肿瘤的调控不仅源于stefins与组织蛋白酶(cathepsin)之间的相互影响,许多新的调控机制相继被报道。本文综述了stefins对肿瘤发生发展的调控作用及其相关机制的研究进展,并总结了stefins作为肿瘤生物标记物和预后监测指标的研究现状。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂Stefins的功能研究进展

Stefins是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族(Cystatins)的一个分支,属于Ⅰ型Cystatins,在人类中主要包括Stefin A和Stefin B。Stefins具有多种生物学功能:Stefin B的基因突变与翁-隆病(Unverricht-Lundborg disease,EPM1)的发生紧密相关;Stefins参与淀粉斑的形成,在阿尔茨海默病的发生、发展中发挥重要作用;近年来关于Stefins在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移中的作用备受关注。本文就Stefins的功能研究进展作一综述。

肝癌微环境中肝星状细胞活化及Stefin B的表达

探讨肝癌微环境中肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化与Stefin B表达情况。采用不同浓度TGF-β_1(5、10和20 ng/m L)、不同浓度肝癌细胞条件培养液(25%、50%和75%)以及TGF-β_1与肝癌细胞条件培养液混合的方法分别处理HSC,免疫细胞化学染色法和Western blotting法检测α-SMA和Stefin B蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖。结果:TGF-β_1与肝癌细胞条件培养液分别单独作用或共同作用时,HSC的α-SMA表达均升高且细胞出现活化,细胞增殖能力均增强;Stefin B在TGF-β_1单独作用时表达下调,而在肝癌细胞条件培养液单独作用及TGF-β_1与肝癌细胞条件培养液共同作用时显著升高。结果表明:肝癌微环境能够促进HSC活化及Stefin B表达。

草鱼Stefin克隆表达、纯化及活性特征鉴定

文章克隆了草鱼（Ctenopharyngodon idellus）Stefin c DNA全长序列,全长294 bp,编码97个氨基酸,无二硫键,N端存在高度保守的Gly（3、4）残基及QXVXG（45-49）序列,比对结果显示其氨基酸序列与Burton＇s mouthbrooder（Haplochromis burtoni）Stefin A1一致性最高,为47.5%。进化树分析表明草鱼Stefin A与Burton＇s mouthbrooder（Haplochromis burtoni）、southern platyfish（Xiphophorus maculatus）、Colisa chuna（Trichogaster chuna）、lamprologini（Neolamprologus brichard）、elephant shark（Callorhinchus milii）及bicolor damselfish（Stegastes partitus）Stefin A聚为一类。将构建的原核表达载体Stefin-Pet30a转入E.coli BL21,以1 mol·L^-1IPTG诱导表达重组Stefin蛋白,而后经梯度尿素洗涤和镍亲和层析纯化,并分别利用SDS-PAGE和TSK-GEL G2000SWxl高效液相色谱检测诱导及纯化效果,SDS-PAGE结果显示重组Stefin蛋白得到高度纯化,最终呈现相对分子量11.4 k D的单一条带;其在高效液相上保留时间25.98 min处亦呈单一活性峰,纯度为96.28%。以荧光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）测活法鉴定重组草鱼Stefin对鲤鱼组织蛋白酶B、L的抑制活性,发现该重组蛋白对二者均体现了明显的抑制活性。

Stefin B调控巨噬细胞极化对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化的影响

目的探讨stefin B(CSTB)调控巨噬细胞极化对肝癌细胞增殖迁移侵袭及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法诱导人单核细胞系THP-1极化成未分化巨噬细胞(M0)、经典活化的巨噬细胞(M1)、替代性活化的巨噬细胞(M2)和肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophage,TAM);构建慢病毒stefin B(LV-CSTB)及对照空载体病毒(LV-NULL),感染各亚型巨噬细胞,ELISA法检测IL-10和IL-12分泌;病毒感染各亚型巨噬细胞后的上清分别制备成条件培养液用于培养MHCC97H细胞,CCK-8法、划痕法和小室法分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力,RT PCR和Western blotting法分别检测细胞E-cadherin、N-cadherin、β-catenin及Twist的mRNA和蛋白表达。结果LV-CSTB感染M0、M2、TAM亚型细胞的上清中IL-10明显增加,感染M1后上清中IL-12明显增加;LV-CSTB感染M0、M2、TAM亚型的条件培养液作用时,MHCC97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显增强,E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显下降,N-cadherin、β-catenin(M0除外)及Twist的mRNA和蛋白表达明显上升。结论Stefin B调控巨噬细胞M0向M2亚型极化,stefin B介导M0、M2、TAM促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT。

Stefin蛋白对人工感染豆状囊尾蚴家兔的免疫保护作用

检测重组蛋白Cpstefin免疫家兔的抗体消长水平并验证其对豆状囊尾蚴感染的免疫保护效果。将本实验室保存的转化重组质粒pGEX-4T-Cpstefin的BL21(DE3)菌种活化,采用IPTG诱导表达后收集菌体进行SDS-PAGE分析鉴定后,运用GST琼脂糖树脂纯化Stefin蛋白,检测重组蛋白浓度。将测定好浓度的重组蛋白分别与弗氏佐剂、206佐剂、氢氧化铝佐剂按1∶1体积比充分乳化后免疫家兔。首次免疫300μg/只,加强免疫200μg/只,每次免疫间隔7 d,共免疫3次,并于第2次加强免疫1周后检测家兔外周血液抗体水平。免疫第30天每只家兔经口感染2000个豆状带绦虫虫卵,攻虫后第58天将家兔安乐死,计数囊荷数并计算各免疫组的减囊率。攻虫后每7 d耳缘静脉采血,检测血清抗体水平。结果显示,对各组家兔注射重组蛋白抗原后,免疫组家兔抗体水平开始升高,经口感染虫卵后,免疫组抗体水平有所下降,但D_(492 nm)值仍保持在2.50以上。剖检家兔计算减囊率,弗氏佐剂组、206佐剂组、氢氧化铝佐剂组减囊率分别为76.70%、66.02%和54.37%。结果表明,豆状囊尾蚴Cpstefin重组蛋白对实验感染豆状囊尾蚴家兔具有免疫保护作用。