从CSF1R/STING/TBK1信号调控肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表型极化探究加味白头翁汤治疗结直肠癌的效应机制

目的:观察加味白头翁汤对结直肠癌MC38细胞荷瘤小鼠瘤体生长及肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润数量的影响,探析加味白头翁汤是否介导TAMs表型重塑以发挥抗肿瘤免疫调节效应。方法:首先构建鼠源MC38细胞株C57BL/6小鼠皮下移植瘤模型,设立模型组、阳性药奥沙利铂组(3 mg·kg^(-1))及加味白头翁汤高、低剂量组23.43、46.86 g·kg^(-1),每组各10只,另设立10只健康小鼠为空白组,观察各组小鼠体质量、瘤体体积及生存状态变化,摘取肿瘤组织、脾脏及外周血,计算瘤体体积变化、抑瘤率及脾脏质量;苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理形态学变化,免疫荧光实验检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD4、CD8、CD206表达水平,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测荷瘤小鼠外周血清中细胞因子转化生长因子(TGF)-β、白细胞介素(IL)-6、趋化因子配体2(CCL2)的分泌水平;其次,使用MC38细胞株与鼠源单核巨噬细胞系RAW264.7细胞在体外构建IL-4诱导的共培养模型,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测加味白头翁汤含药血清的细胞增殖抑制作用,Transwell实验检测IL-4诱导的M2型巨噬细胞对MC38细胞侵袭能力的影响,流式细胞术检测加味白头翁汤含药血清对IL-4诱导的M2型巨噬细胞干预后膜上CD86的表达变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测加味白头翁汤含药血清对共培养后M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-12及M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平的影响;最后,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测荷瘤小鼠肿瘤组织中集落刺激因子1受体(CSF1R)、干扰素基因刺激蛋白(STING)、TANK结合激酶1(TBK1)蛋白表达水平。结果:体内实验结果表明,与模型组比较,加味白头翁汤能明显抑制荷瘤小鼠瘤体的生长。免疫荧光实验结果表明加味白头翁汤能增加荷瘤小鼠肿瘤组织中CD8+T细胞浸润数量,降低CD206+TAMs浸润数量,且能下调荷瘤小鼠外周血清中细胞因子IL-6、TGF-β、CCL2的分泌水平;在体外实验结果中,加味白头翁汤含药血清无明显的细胞增殖抑制作用,但与RAW264.7细胞共孵育后的细胞上清液却能抑制MC38细胞的增殖活性,且IL-4诱导的M2型巨噬细胞能增强MC38细胞的侵袭能力,这一效应却能被加味白头翁汤含药血清呈浓度依赖性抑制。同时,Real-time PCR检测结果发现加味白头翁汤含药血清能上调M1型巨噬细胞相关极化因子CD86、iNOS、IL-12 mRNA表达水平,下调M2型巨噬细胞相关极化因子CD206、CD163、IL-10 mRNA表达水平,流式细胞术结果也证实了加味白头翁汤含药血清能增加CD86+M1型巨噬细胞复极化数量,这表明加味白头翁汤能诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞复极化以发挥抗肿瘤生长作用。最后,Western blot检测结果表明加味白头翁汤能下调荷瘤小鼠肿瘤组织中CSF1R蛋白表达,上调STING、TBK1蛋白表达。结论:加味白头翁汤能下调CD206+TAMs浸润数量,增加CD8+T细胞浸润,从而发挥对结直肠癌生长抑制的抗肿瘤免疫调节效应,这可能与其调节CSF1R信号,进而活化STING/TBK1信号通路,诱导TAMs表型重塑有关。

藁本内酯对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织损伤的影响

目的研究藁本内酯调控干扰素基因刺激蛋白(STING)/TANK结合激酶1(TBK1)/核因子-κB(NF-κB)信号对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织损伤的影响。方法将小鼠分成对照组、模型组(LPS肺损伤小鼠模型)、实验低剂量组(LPS肺损伤小鼠模型,20 mg·kg^(-1)藁本内酯)、实验中剂量组(LPS肺损伤小鼠模型,60 mg·kg^(-1)藁本内酯)、实验高剂量组(LPS肺损伤小鼠模型,100 mg·kg^(-1)的藁本内酯)、DMXAA组(LPS肺损伤小鼠模型,100 mg·kg^(-1)的藁本内酯、STING信号激动药DMXAA)。用蛋白质印迹法检测STING、p-TBK1、TBK1、p-p65、p65蛋白的表达水平,用二喹啉甲酸(BCA)法检测肺泡灌洗液总蛋白,用瑞士吉姆萨染色计数肺泡灌洗液中炎性细胞数目,用酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,用硫代巴比妥酸法检测肺组织中丙二醛(MDA)含量。结果对照组、模型组和实验低、中、高剂量组及DMXAA组的STING蛋白相对表达水平分别为0.13±0.03、0.46±0.02、0.36±0.04、0.27±0.02、0.20±0.03和0.38±0.04,p-TBK1/TBK1蛋白比值分别为0.15±0.02、0.56±0.02、0.43±0.01、0.31±0.01、0.20±0.02和0.30±0.02,p-p65/p65蛋白比值分别为0.24±0.01、0.66±0.03、0.41±0.02、0.32±0.04、0.22±0.02和0.42±0.03,肺泡灌洗液中总蛋白含量分别为(173.79±15.44)、(304.21±19.29)、(243.59±17.60)、(212.51±18.24)、(187.11±11.59)和(241.69±30.12)μg·mL^(-1),巨噬细胞数目分别为(0.11±0.02)×10^(8)、(0.94±0.09)×10^(8)、(0.72±0.08)×10^(8)、(0.57±0.04)×10^(8)、(0.41±0.04)×10^(8)和(0.71±0.08)×10^(8)cell·mL^(-1),模型组的上述指标与对照组相比,实验低、中、高剂量组的上述指标与模型组相比,DMXAA组的上述指标与实验高剂量组相比,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论藁本内酯抑制STING/TBK1/NF-κB信号减轻LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织损伤。

异钩藤碱对急性脑梗死大鼠认知障碍的影响及机制研究

目的探讨异钩藤碱对急性脑梗死大鼠认知障碍的影响及相应机制。方法将144只SD大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组、急性脑梗死组、异钩藤碱低剂量组、异钩藤碱高剂量组、尼莫地平组、异钩藤碱高剂量+干扰素基因刺激蛋白(STING)激动剂(ADU-S100)组,每组24只。除假手术组外,其他各组大鼠均采用线栓闭塞大脑中动脉法构建急性脑梗死大鼠模型,假手术组仅游离右侧颈外动脉、颈总动脉和颈内动脉,不做插入线栓处理。建模成功后立即给药,异钩藤碱低剂量组和异钩藤碱高剂量组大鼠分别灌胃5 mg/kg、20 mg/kg异钩藤碱,且均需腹腔注射等量的等渗盐水;尼莫地平组大鼠需灌胃30 mg/kg尼莫地平,且还需腹腔注射等量的等渗盐水;异钩藤碱高剂量+ADU-S100组大鼠需灌胃20 mg/kg异钩藤碱且腹腔注射20 mg/kg ADU-S100;假手术组、急性脑梗死组大鼠均需灌胃10 ml/kg与腹腔注射10 ml/kg的等渗盐水。给药1次/d,持续2周。末次给药处理24 h后,采用Zela-Longa法对所有大鼠进行神经功能评分,并进行Morris水迷宫实验,记录大鼠的逃避潜伏期及原平台象限停留次数。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;检测各组大鼠脑组织含水量;采用2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色测定各组大鼠脑梗死体积;采用伊文思蓝检测各组大鼠血-脑屏障通透性;采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠脑组织中闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)信使核糖核酸(mRNA)表达;采用免疫印迹检测大鼠脑组织中STING、磷酸化TANK结合激酶1(p-TBK1)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)蛋白表达,并进行组间比较。结果(1)与假手术组相比,急性脑梗死组末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.96±0.32)分比0分]、脑组织含水量[(86.9±3.2)%比(71.8±3.1)%]、血清TNF-α[(86.7±3.5)ng/L比(35.6±1.7)ng/L]、IL-6[(167.8±6.1)ng/L比(50.2±2.2)ng/L]、脑梗死体积[(28.6±1.3)mm 3比0 mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.57±0.13)g/L比(0.96±0.08)g/L]及STING[(1.83±0.16)比(0.86±0.08)]、p-TBK1[(0.89±0.07)比(0.41±0.03)]、p-IRF3[(0.67±0.05)比(0.13±0.01)]蛋白表达均升高,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.45±0.04)比(1.00±0.00)]、occludin mRNA[(0.23±0.02)比(1.00±0.00)]表达均降低,逃避潜伏期延长[(33.6±1.6)s比(12.3±0.5)s],原平台象限停留次数减少[(5.9±0.2)次比(15.7±0.4)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)与急性脑梗死组比较,异钩藤碱低剂量组、异钩藤碱高剂量组、尼莫地平组大鼠末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.37±0.21)、(1.14±0.17)、(1.18±0.13)分比(2.96±0.32)分]、脑组织含水量[(81.8±3.0)%、(74.9±3.0)%、(74.3±2.9)%比(86.9±3.2)%]、血清TNF-α[(71.1±1.4)、(43.4±2.0)、(41.5±1.9)ng/L比(86.7±3.5)ng/L]、IL-6[(129.8±5.4)、(81.2±3.8)、(80.0±3.6)ng/L比(167.8±6.1)ng/L]、脑梗死体积[(21.7±1.0)、(10.5±0.5)、(10.7±0.5)mm 3比(28.6±1.3)mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.39±0.12)、(1.16±0.10)、(1.18±0.19)g/L比(1.57±0.13)g/L]及STING[(1.50±0.14)、(1.02±0.11)、(1.01±0.09)比(1.83±0.16)]、p-TBK1[(0.75±0.05)、(0.54±0.04)、(0.52±0.05)比(0.89±0.07)]、p-IRF3[(0.51±0.05)、(0.25±0.02)、(0.27±0.02)比(0.67±0.05)]蛋白表达均降低,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.58±0.05)、(0.87±0.07)、(0.89±0.09)比(0.45±0.04)]、occludin mRNA[(0.36±0.03)、(0.71±0.06)、(0.69±0.05)比(0.23±0.02)]表达均升高,逃避潜伏期缩短[(28.6±1.0)、(16.5±0.7)、(16.4±0.7)s比(33.6±1.6)s],原平台象限停留次数增加[(8.2±0.3)、(12.8±0.5)、(12.9±0.5)次比(5.9±0.2)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。(3)与异钩藤碱高剂量组比较,异钩藤碱高剂量+ADU-S100组末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.12±0.14)分比(1.14±0.17)分]、脑组织含水量[(78.7±3.2)%比(74.9±3.0)%]、血清TNF-α[(59.7±2.1)ng/L比(43.4±2.0)ng/L]、IL-6[(118.9±4.6)ng/L比(81.2±3.8)ng/L]、脑梗死体积[(16.6±0.4)mm 3比(10.5±0.5)mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.36±0.10)g/L比(1.16±0.10)g/L]及STING[(1.37±0.12)比(1.02±0.11)]、p-TBK1[(0.67±0.05)比(0.54±0.04)]、p-IRF3[(0.39±0.03)比(0.25±0.02)]蛋白表达均升高,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.63±0.05)比(0.87±0.07)]、occludin mRNA[(0.46±0.05)比(0.71±0.06)]表达均降低,逃避潜伏期延长[(23.4±1.0)s比(16.5±0.7)s],原平台象限停留次数减少[(9.6±0.3)次比(12.8±0.5)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论异钩藤碱可抑制急性脑梗死大鼠炎症、减少血-脑屏障损伤、降低脑水肿程度,改善认知障碍,其机制可能与抑制STING/TBK1/IRF3通路有关。