The vital role of CovS in the establishment of Streptococcus equi subsp.zooepidemicus virulence

Streptococcus equi subsp.zooepidemicus(SEZ)is an important zoonotic agent.Here,a virulence-attenuated strain M35246 derived from natural variation of wild-type SEZ ATCC35246 was found.M35246 showed a deletion of 25contiguous genes as well as a loss-of-function mutation in covS.Subsequently,a 25-gene-deleted strain(ΔPI),a covS-mutant strain(Mcov S),and relevant complementary strains were constructed and investigated.M35246 and Mcov S were significantly less encapsulated and exhibited poorer anti-phagocytic capacity compared to wild-type SEZ.McovS was significantly more sensitive toβ-lactams,aminoglycosides,macrolides,and lincosamides than wild-type SEZ.M35246,McovS,andΔPI exhibited an increase in median lethal dose(LD_(50))in mice by 10~5,10~5,and 5 times when compared to wild-type SEZ,respectively.Neither M35246 nor McovS were isolated from mice 48 h after being challenged with approximately 2000 times the LD_(50)of wild-type SEZ.Transcriptome analysis showed that 668 significantly differentially expressed genes existed between McovS and wild-type SEZ.Numerous virulence factor-encoding genes and anabolicrelated genes in McovS that were involved in anti-phagocytosis,capsule formation,pathogenicity,and antibiotic resistance were downregulated significantly relative to the wild-type strain.This study revealed that the CovS plays a vital role in the establishment of SEZ virulence.

羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验小鼠免疫攻毒法研究

为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护临界剂量,并在确认小鼠品系后开展平行关系研究,从而筛选出在小鼠模型上能够体现疫苗差异的最佳攻毒剂量。结果显示:合格疫苗1/2稀释度为最小免疫剂量,1/4稀释度为不符合规定的临界剂量;KM小鼠为替代方法最合适的小鼠品系;最佳攻毒剂量为使用2 MLD混合菌液,对免疫组和对照组进行攻毒,对照小鼠全部死亡,免疫小鼠至少保护70%。本研究建立了羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验实验动物免疫攻毒替代方法,这将有助于提升该类疫苗效力检验的稳定性和可靠性,为羊败血性链球菌病防控提供有力支撑。

致病性马兽疫链球菌的分离鉴定、生物学特性及其M-like基因的序列分析

为鉴定锦州某猪场引起关节炎病疫情的病原,本研究将患猪关节液在血平板培养基上培养进行细菌分离;对分离细菌进行形态学观察、生化反应、致病性试验及药物敏感性试验;并对其M-like基因进行克隆和测序分析。结果在显微镜下观察到周围具有透明的β溶血环的革兰氏阳性中长链球菌,经生化反应及M-like基因鉴定为马兽疫链球菌(命名为10JZ12);分离株10JZ12对小鼠的致死剂量为1.75×108cfu;并对苯唑西林、青霉素G、红霉素、克拉霉素、克林霉素、米诺环素、环丙沙星、左氟沙星、多粘菌素B、呋喃妥因敏感,对氯霉素、四环素、诺氟沙星、复方新诺明不敏感。

马链球菌马亚种FNEB蛋白的截短表达及其免疫保护性研究

为研究马链球菌马亚种FNEB蛋白的免疫保护性,本研究采用PCR方法从马链球菌马亚种新疆分离株中扩增FNEB基因部分片段,克隆于原核表达载体p ET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和western blot分析显示,重组蛋白大小约60 ku,具有良好的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫小鼠后,以马链球菌马亚种新疆分离株进行攻毒,结果显示该重组蛋白对免疫组小鼠具有保护力,保护率为65%。本研究克隆了马链球菌马亚种的FNEB截短基因并表达了相应重组蛋白,免疫小鼠后能够提供较好的保护,为重组FNEB蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。

马链球菌兽疫亚种类M基因和猪链球菌2型mrp基因片段的融合表达及仔猪免疫试验

将含猪链球菌 2型mrp及马链球菌兽疫亚种类M基因融合片段的重组质粒转化大肠杆菌BL 2 1,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,表达了相对分子质量为 6 0 0 0 0左右的融合蛋白。利用组氨酸亲和层析柱 ,获得了纯化的融合蛋白 ,质量浓度为 4 2 μg·mL-1。以纯化的融合蛋白、宿主菌BL 2 1经IPTG诱导表达后的超声波破碎上清、马链球菌兽疫亚种ATCC 35 2 4 6株和猪链球菌 2型HA 980 1株制备的二联灭活苗为免疫原 ,分别免疫 30头仔猪。初次免疫 1月后 ,以同样的剂量再次免疫 ,3周后以 5×LD50 的ATCC 35 2 4 6和HA 980 1强毒株进行攻击。结果 ,纯化融合蛋白免疫组的免疫保护率达 6 0 % ,BL 2 1上清免疫组的免疫保护率为 5 0 % ,全菌二联灭活菌苗的免疫保护率达 90 %。

马链球菌兽疫亚种类M蛋白的基因克隆、序列分析及其在猪源链球菌的检测

根据已发表的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp .zooepidemicus)马源株的类M蛋白基因序列 ,设计和合成一对引物 ,以兽疫亚种猪源ATCC35 2 4 6株的基因组DNA为模板 ,通过PCR技术 ,扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET_32a(+)中 ,测定其序列 ,GenBank接收号为AY2 6 3781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框 ,全长为 1137bp ,编码 379个氨基酸残基。经DNAStar软件分析 ,ATCC35 2 4 6株类M蛋白基因与兽疫亚种马源W6 0株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为 86 9%、30 8%、2 9 4 % ;推导的氨基酸序列的同源性分别为 84 3%、2 1 9%、2 3 4 %。但ATCC35 2 4 6株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验 ,检测 34株猪源链球菌类M蛋白基因 ,发现所有 16株C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因 ,而所有猪链球菌 (Streptococcussuis) 1型和 2型菌株及S群、B群、D群链球菌共 13株均不能检出类M蛋白基因 ,而 5株未鉴定的猪源链球菌中 3株能检测出类M基因。

马流产沙门菌鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌SeM蛋白免疫效应分析

为研究马流产沙门菌(Salmonella abortus equi)鞭毛蛋白FliC对马腺疫链球菌(Streptococcus equi subsp.equi)SeM蛋白免疫效果的增强效应,为马腺疫新型高效疫苗的研发奠定基础。本研究构建并诱导表达了FliC,经亲和层析纯化目的蛋白,Western blot检测其免疫原性。将该纯化后FliC与SeM蛋白联合免疫C57BL/6小鼠,免疫后对小鼠进行抗体水平、抗体类型和攻毒保护力的检测。结果表明,成功表达、纯化了FliC重组蛋白,SDSPAGE电泳检测显示该蛋白质为52ku。抗体分型检测结果显示产生的抗体主要以IgG1为主;免疫30d后FliC+SeM免疫组的攻毒保护率为87%,高于SeM免疫组的保护率67%。马流产沙门菌来源的鞭毛蛋白FliC能够增强SeM蛋白的免疫保护效果,该结果为进一步更好地利用SeM蛋白奠定了基础。

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。

检测两种猪源链球菌抗体间接ELISA方法的筛选与应用

目的建立检测马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp zooepidemius,Sez)与猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,Ss2)抗体的间接ELISA方法。方法选用Sez与Ss2的全菌(WAC)、超声波抗原(UA)、英膜多糖(capsular polysaccha-ride,CPS)作为抗原,筛选最优的检测两种抗体间接ELISA方法。结果3种抗原检测60份免疫后的血清表明,Sez与Ss2的CPS抗体阳性率分别为98.3%、96.7%,WAC为91.7%、85%,UA均为88.3%,前者与后两者差异显著(P<0.05)。检测免疫前50份血清、免疫后156份血清、60份临床采集血样表明,10%猪免疫前呈现Sez与Ss2的CPS抗体阳性;免疫后CPS抗体阳性率均在90%以上,此结果与免疫保护率相一致;苏州与常州两个猪场的血清各30份,CPS抗体阳性率均在6.7%左右。结论CPS-ELISA方法具有较好的稳定性、特异性、灵敏性,此方法在诊断和流行病学调查方面有价值。

猪源马链球菌兽疫亚种中国分离株类M基因特性分析

目的阐明国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因的特性,为疫苗研制提供指导。方法利用PCR技术,扩增国内9省市从1974～2003年分离的9株马链球菌兽疫亚种类M基因,并进行克隆、测序及序列分析。结果发现7株类M基因长度为1137bp,含一个阅读框,CG-74-63和CP-0104株的长度分别为1143bp及1125bp。除1株关节炎分离株CP-0104外,引致败血症的8株菌类M基因的核苷酸同源性高达95.4%～99.9%,推导的相应氨基酸序列同源性高达92.1%～100%。9株猪源菌与马源菌株及人源菌株类M基因的核苷酸同源性分别为81.6%～87.0%、81.7%～91.8%。9株猪源分离株类M蛋白信号肽、C末端细胞锚定区的序列均高度同源;除CP-0104外,其余8株高变区高度同源。结论国内不同区域猪源马链球菌兽疫亚种分离株类M基因同源性高。

猪源马链球菌兽疫亚种灭活疫苗对小鼠的免疫效力评价

【目的】评价中国不同地区猪源马链球菌兽疫亚种分离株抗原性的差异,为猪链球菌病疫苗的研制提供指导。【方法】取从国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种分离株,分别制备灭活疫苗,免疫12周龄ICR小鼠,用同源菌株和ATCC35246株攻击。【结果】以同源菌株攻击免疫小鼠,除CG-74-63株外,其余菌株的保护率均在90%以上;而以异源菌株ATCC35246进行攻击,免疫小鼠的免疫保护率为80%～100%。【结论】中国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有保护性。

2种猪源链球菌对猪、兔的致病性试验

检测了4株猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2, SS2)和2株马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, SEZ)对猪、兔的致病性.SS2-1、SS2-H及SS2-006444株均分离自发病猪内脏,前2株毒力因子表现型为MRP+EF+SLY+,后者为MRP-EF-SLY-;SS2-D株为国外引进的SS2人源株,作为对照,其毒力因子的表现型为MRP+EF·SLY+;SEZ-CY和SEZ-CN株均分离自发病猪并经鉴定.SS2-1、SS2-H、SEZ-CY和SEZ-CN株对猪(2～3头/组)的最小致死量分别为106、107、104和108 cfu;对兔(2～3只/组)的最小致死量分别为100～1 000、1 000、 100和105 cfu;SS2-D株108 cfu对猪不致死,对兔的最小致死量为108 cfu,而SS2-006444对猪、兔无致病性.显示SS2毒力因子与其对猪、兔的致病性有关;SS2与SEZ菌株对兔或猪的致病性一致,可用兔取代猪做试验;SS2和SEZ菌株通过腹腔、皮下、肌肉或静脉注射均可感染兔(2～4只/组),并致死,SEZ还可经口、鼻感染;SEZ与SS2静脉感染猪后10 min即可检出细菌,此后2～4 h为无菌血症阶段,之后重新出现.

猪源马链球菌兽疫亚种类 M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。

利用遗传算法优化透明质酸发酵培养基

运用遗传算法对透明质酸（HA）产生菌——马链球菌兽瘟亚种ATCC39920发酵培养基的6种组份进行了优化研究。每个长度为36位的染色体编码一种培养基配方，以HA产量为适应度函数值对其进行评价。经过4代的进化，各参数的取值范围收敛于最优区域。最终以40个实验样本完成了6种培养基成分、64个浓度水平的优化选择。优化后的培养基的构成为：葡萄糖44．0g／L，酵母膏5．2g／L，蛋白胨8．4g／L，牛肉膏9．8g／L，KH2PO4 1．45g／L，MgSO4 2．8g／L。采用优化培养基的HA产量达0．395g／L，较原培养基提高了31．2％，生产成本也大幅度降低。

猪源链球菌溶血性的检测

用平板法和上清法检测了 1 9株猪源链球菌的溶血性 ,并通过加入还原剂或氧化剂分别作活化和抑制试验 ,对各菌株溶血素的性质做了初步鉴定。其中 8株猪链球菌 2型菌株在血平板上的溶血性较弱 ,仅为α溶血或弱 β溶血 ,但在THB和 5 %血清THB中都可产生很强的溶血性 ,其溶血性可被还原剂活化 ,被氧化剂和胆固醇所抑制 ,卵磷脂对其活性则没有影响 ,属于巯基活化类 (类SLO)溶血素。 9株马链球菌兽疫亚种菌株在血平板上呈显著的 β溶血 ,在不含血清THB中不能产生溶血性 ,在含血清的THB中可产生较强的溶血性 ,其活性不被还原剂活化 ,不被氧化剂抑制 ,胆固醇能抑制大部分活性 ,卵磷脂则可全部抑制 ,属于类SLS溶血素。两株非典型兰氏C群链球菌菌株在血平板上呈显著的 β溶血 ,在THB中显示了非常强的溶血性 ,其活性不被还原剂活化、不被氧化剂抑制或卵磷脂抑制 ,但被胆固醇强烈抑制 ,属于非SLO、非SLS溶血素。

猪链球菌病及其疫苗研究进展

猪链球菌病(Swine streptococosis)是由多种不同血清群的致病性链球菌引起的一种疾病总称。近年来猪链球菌病在我国已广泛流行,特别是C群兽疫链球菌(现称马链球菌兽疫亚种)病,严重影响着我国的养殖业,造成了很大的经济损失。文章主要从其病原学、流行病学、毒力因子、病理变化、疫苗的研究进展做了系统的阐述,为该病的深入研究提供参考。

马链球菌对树突状细胞Toll样受体和MyD88及细胞因子mRNA表达的影响

为探究马链球菌马亚种(Streptococcus equi subsp.equi,S.equi)对小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)TLR1、TLR2、TLR6、MyD88、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-αmRNA表达的影响,用GM-CSF、IL-4细胞因子刺激小鼠骨髓细胞使其诱导分化成未成熟的BMDCs,感染S.equi后16、20、26h,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测感染组及未感染组细胞TLRs、MyD88和细胞因子mRNA的表达情况。结果显示,S.equi感染BMDCs后16、20、26h,TLR1、TLR2、TLR6、MyD88mRNA的表达量均显著或极显著的高于未感染组(P<0.05或P<0.01)。S.equi感染DCs后16、26h,IL-1的分泌量较未感染组没有变化(P>0.05),IL-10、TNF-α的分泌量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)。IL-6在S.equi感染DCs后16h的分泌量显著增加(P<0.05),但感染后26h无显著变化(P>0.05)。IL-12在S.equi感染DCs后16h的表达没有变化(P>0.05),但感染后26h分泌量有所增加(P<0.05)。说明S.equi具有调节DCs TLRs、MyD88和细胞因子表达的能力,从而介导机体的免疫应答反应。

2种猪源链球菌菌体细胞表面疏水性及体外结合纤连蛋白的检测

采用盐析法测定了马链球菌兽疫亚种ATCC35246株(简称35246)和猪链球菌2型9801株(简称HA9801)的表面疏水性。35246在浓度为1.0mol/L的硫酸铵中2min内析出,HA9801在0.6mol/L的硫酸铵中析出。用不同浓度的人纤连蛋白(Fn)包被ELISA板,采用ELISA方法检测了对数生长后期的35246和HA9801体外结合固定Fn的情况。35246的D415随细菌浓度的升高而增大,而9801的D415与对照相比,经t检验差异不显著(P>0.05)。采用间接免疫荧光试验,对二者体外结合游离的人Fn的情况进行了检测,结果在2种细菌周围均见绿色荧光。结果表明,二菌均为表面疏水菌;35246株既可结合固定的Fn,又可结合游离的Fn;而HA9801株仅与游离的Fn结合。

类M蛋白亚单位疫苗的佐剂筛选

将铝胶、ISA2 0 6和CpG三种佐剂分别与热盐酸提取的马链球菌兽疫亚种 (Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35 2 4 6株类M蛋白配合 ,制成疫苗接种 2 0日龄的小鼠 ,并设不加佐剂的类M蛋白亚单位疫苗免疫对照组。二次免疫后用ATCC35 2 4 6株活菌攻击 ,铝胶、ISA2 0 6、CpG和对照组的保护率分别为 75 % ( 1 2 /1 6)、81 .2 5 % ( 1 3/1 6)、68.75 % ( 1 1 /1 6)和5 6.2 5 % ( 9/1 6)。试验结果表明ISA2 0 6的免疫增强作用高于其他两种佐剂 ,可望与类M蛋白亚单位疫苗配合 ,用于预防猪链球菌病。

猪源马链球菌兽疫亚种表达的类M蛋白黏附抑制性单抗的获得

根据马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi subsp.zooepidemicus）猪源株ATCC35246株的类M蛋白基因序列,通过PCR技术,扩增出无信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a（＋）中。重组质粒经酶切鉴定和测序后,在大肠杆菌BL21中表达,获得60kDa产物,Western blot显示,其与ATCC35246株多克隆抗血清反应,抗原性良好。以His亲和层析柱纯化重组类M蛋白作为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株,特异性检测显示其与A群链球菌、猪链球菌2型以及马链球菌马亚种等没有交叉反应。单抗亚类鉴定显示,其中6株为IgG1,3株为IgG2,另外3株为IgM。从腹水中纯化的单抗效价为2.56×10^4-1.01×10^5。黏附抑制实验显示,其中一株单抗能阻断类M蛋白黏附HEp-2细胞。