变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP免疫动物实验研究

目的 :探讨变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP作为基因疫苗 ,在BALB/c小鼠中的特异性体液免疫应答。方法 :将真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP分别肌注免疫BALB/c小鼠 ,用间接ELISA法检测小鼠血清抗PAc抗体滴度。结果 :真核表达质粒pcDNA3/pacA免疫组的 6只小鼠于首次免疫的第 4周全部出现抗体阳转 ,真核表达质粒pcDNA3/pacP免疫组 6只中有 4只在第 4周出现抗体阳转。结论

变异链球菌表面蛋白PAc基因A区与霍乱毒素B亚单位融合基因植物表达载体的构建

目的构建变异链球菌表面蛋白PAc A区与霍乱毒素B亚单位的植物表达载体,为可食嵌合体防龋疫苗的进一步研究提供实验基础。方法从中间载体pBPC55获得含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的片段,定向连接到植物双元表达载体pCAMBIA2301上,构建重组载体p2355;通过PCR扩增从重组质粒pEAC10中获得表面蛋白PAcA区与霍乱毒素B亚单位的融合基因pacA-ctxB,克隆至重组质粒p2355中,构建植物表达载体p2355-PAcA/CTB,电转化法导入根癌农杆菌EHA105。PCR及酶切鉴定。结果 PCR扩增得到了含35s启动子、NOS终止子和多克隆位点的1.1kb大小片段,经酶切鉴定,该片段已经插入到植物双元载体pCAMBIA2301中。PCR扩增得到了pacA-ctxB基因;构建的质粒p2355-PAcA/CTB经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切及PCR检测,均得到1.7kb大小的片段,与预计的嵌合目的基因片段大小相同。结论成功构建pacA-ctxB融合基因的植物表达载体p2355-PAcA/CTB。

重组格式链球菌疫苗的研制现状

格式链球菌是一种非致病的口腔共生菌,是一种新型疫苗载体。M6蛋白具有分泌和锚定蛋白的作用,借助分子生物学技术可将M6蛋白的编码基因整合入格式链球菌的染色体中,再将外源抗原与M6蛋白进行融合表达。本文综述了细菌、病毒和寄生虫重组格式链球菌疫苗的构建及其作用机制等方面的研制现状。

携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建

目的通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区(glucan bind-ing domain,GBD)及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础。方法通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因(signal)。将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序。将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序。结果真核表达质粒pSSG构建正确,目的基因sp、gg和signal定向插入至真核表达载体。结论真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础。

戈登链球菌的生物学特性及在黏膜疫苗的应用

戈登氏链球菌是一种非致病性革兰氏阳性黏膜共生菌,参与组成人类口腔正常菌群。它具有特殊的生物学特性,非常适合作为黏膜疫苗的载体。了解戈登氏链球菌的生物学特性,常用表达体系及该菌在黏膜疫苗的应用情况,将为其黏膜疫苗的进一步研制提供重要参考。

esat6基因表达载体的构建及其在戈登链球菌中的表达

为了构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因表达载体并在戈登链球菌GP251中进行分泌表达,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增esat6基因,将esat6基因TA克隆到pMD18-T,构建pMD18-esat6重组载体。酶切消化pMD18-esat6,将esat6基因亚克隆到质粒PSMB104,生成PSMB104-esat6重组载体,用于转化感受态戈登链球菌表达菌株GP251。用Tricine-SDS-PAGE和Western印迹检测esat6蛋白的表达,并用ELISA技术检测该蛋白的分泌表达量。结果表明,酶切、PCR、测序及蛋白表达测定证实esat6基因表达载体构建成功,转化戈登链球菌表达菌株GP251后可分泌表达出相对分子质量约10kD的esat6蛋白,Western印迹证明蛋白有较好的免疫原性。esat6基因表达载体的成功构建并能在戈登链球菌GP251中进行分泌表达,为研究esat6的免疫原性奠定了一定的基础。