猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用

根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)的基因序列,各设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列,分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf,确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白.用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位.用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物.证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原.

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导上皮细胞融合和凋亡

猪链球菌 2型 (SS2 )溶菌酶释放蛋白 (MRP)的致病作用迄今不明 ,为此 ,以HEp 2细胞为上皮细胞体外模型 ,将纯化的MRP溶液和细胞共孵育 ,光镜观察 ,发现MRP可诱导细胞发生两种典型形态学变化 :一是诱导细胞融合形成多核巨细胞 ,随后巨细胞发生凋亡 ;二是诱导单个细胞凋亡。透射电镜观察和流式细胞分析确证MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能 ,凋亡率达 1 8%。证明MRP可单独作为SS2的毒力因子。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白的黏附作用

为研究猪链球菌 2型 (SS2 )的毒力因子溶菌酶释放蛋白 (MRP)的黏附作用 ,进行了如下试验 :1 用黏附计数法比较菌株HA980 1(MRP+ )和SH0 0 6 4 4 4 (MRP-)的黏附动力学 ,两菌株均能黏附于HEp 2细胞 ,MRP+ 株的最大黏附菌数显著高于MRP+ 株 (P <0 0 5 ) 。 2 菌体置 5 6℃ 1h ,或用胰酶或半乳糖预处理 ,细菌黏附力完全丧失 ;分别用高碘酸、溶菌酶、秋水仙素和DNaseⅠ处理HEp 2细胞 ,前者可完全阻断HA980 1对它的黏附 ,后三者使黏附菌数显著下降。3 用纯化的MRP处理HEp 2细胞 ,或用抗MRP兔血清或MRP的单克隆抗体处理菌体 ,MRP+ 株的黏附菌数显著降低(P <0 0 5 ) ,但不能被完全抑制 ;用抗MRP-株全菌兔血清处理菌体 ,也能降低MRP+ 株的黏附菌数。 4 半乳糖或 5 6℃预处理MRP ,使其完全丧失对HA980 1的黏附抑制功能 ,但胰酶、过氧化氢和巯基乙醇的预处理没有明显的影响。结论 :MRP是SS2的一种黏附素 。

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白诱导血管内皮细胞融合

猪链球菌2型(SS2)主要引起人和猪的脑膜炎,但其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)对构成血脑屏障的微血管内皮细胞有何致病作用迄今不明。为此分离仔兔脾微血管内皮细胞(SMEC),纯化后用SV40-T 抗原转化后用作试验的细胞模型。将单层SMEC 和电泳纯MRP 溶液共孵育,染色后,光镜观察,发现MRP 可诱导SMEC发生两种典型形态学变化:致密细胞单层中出现巨大空洞而呈网状;空洞内有细胞融合,形成多核巨细胞,随后巨细胞核极度浓缩释出,巨细胞消失。研究结果表明, MRP 单独足以破坏大脑的血管内皮细胞屏障。

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。

猪链球菌2型MRP与FBPS部分片段串联基因的原核表达

根据猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)的基因序列,选取可能含有抗原决定簇的两片段,各设计合成一对引物,使之含有共同的酶切位点。通过T4DNA连接酶串联两片段,构建原核表达载体pET32a-mrp-fbps,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度,不同浓度IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,表达约为80kD的融合蛋白。Westernblot结果表明重组蛋白可被SS2阳性血清所识别。证实串联表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,是重要的保护性抗原,本试验为进一步研究猪链球菌亚单位疫苗奠定了基础。