Streptomyces sp.N2所产农抗N2对桔青霉的拮抗活性及作用机制研究

【目的】Streptomyces sp.N2是本课题组分离筛选到的一株可产新型抗真菌活性物质(3-甲基-3,5-氨基-4-烯-吡喃-2-酮,分子式为C6H7O2N,农抗N2)的新种,此活性物质对桔青霉具有良好的拮抗效果。从生长特征、细胞形态学等角度,为揭示农抗N2在桔青霉生长发育中的抑菌作用机理奠定基础。【方法】首先采用常量培养基稀释法测定了农抗N2对桔青霉的最低抑菌浓度、杯碟法测定了不同浓度农抗N2对桔青霉的抑菌活性菌丝和生长量法测定了不同浓度农抗N2对桔青霉生长曲线的影响,并通过扫描电镜及透射电镜探究了农抗N2对桔青霉超微结构的影响。【结果】Streptomyces sp.N2所产农抗N2对桔青霉有较强的抑制作用,而且其机理初步判定为破坏桔青霉菌丝的菌丝结构,推迟了桔青霉对数期的到来而抑制菌体的生长。菌体最低抑菌浓度(3 d)为5.77μg/mL,其对应的抑菌圈大小为(13.04±1.06)mm。药液处理后,桔青霉生长对数期推迟了2 d。由扫描电镜以及透射电镜结果可推测,农抗N2可干扰桔青霉细胞壁合成,破坏细胞膜结构,致使细胞发生质壁分离。【结论】农抗N2对桔青霉的菌丝生长具有很强的抑制作用,且具有浓度效应,其对桔青霉的形态和结构有很大的破坏作用,可以推测农抗N2能够影响桔青霉细胞壁相关蛋白的合成,使细胞壁的通透性增强,影响其细胞膜及内部细胞器。

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。

金褐霉素产生菌——金褐链霉菌固体种子培养的研究

对金褐链霉菌（Streptomyces aureofuscus.n.sp）固体培养基进行筛选，筛选出金褐链霉菌每支斜面产孢子达120多亿个的固体培养基，约是原先所用培养基产孢量的4000倍，培养时间缩短为5～6d。同时初步探讨了金褐链霉菌在此培养基上有利于代谢产物金褐霉素的合成，有利于接种摇瓶进行发酵产金褐霉素，且有利于菌种的保藏。

海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173合成的2-吲哚酮生物碱

【背景】海洋来源的天然产物近年来已成为小分子药物的重要来源。对海洋链霉菌Streptomyces sp. B9173的基因组分析显示,该菌包含多种天然产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】挖掘B9173菌株中未知的次级代谢产物,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物。【方法】利用HPLC/LC-MS结合的方法,排除了该菌株产生的已知化合物,确定3个未知化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱和高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,最后得到化合物单体。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定。【结果】确定3个化合物分别是色胺酮、甲基异靛蓝和N,N-二甲基异靛蓝,三者都属于2-吲哚酮生物碱。其中色胺酮具有非常广的生物活性,包括抗菌、抗肿瘤、抗炎症等,是药物开发的良好前体,这是首次在细菌中被分离得到。甲基异靛蓝是我国临床治疗慢性粒细胞白血病的药物,这是首次在微生物发酵液中被分离得到。目前这3个化合物均主要依赖化学合成。本研究结合B9173菌株的代谢背景,推测了3个化合物的生物合成途径。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从B9173菌株的发酵液中分离鉴定了3个2-吲哚酮生物碱,丰富了微生物活性天然产物的种类,对3个化合物生物合成途径的推测也为进一步研究色胺酮和甲基异靛蓝的生物合成机制奠定基础,后续可利用合成生物学技术重构这类化合物的生物合成途径,提供更便捷、低成本的生物合成方法。